Механизмы сохранения нуклеотидной последовательности ДНК. Репарация. Молекулярный состав клетки Компенсация функций, нарушенных в результате мутаций

На разных цепях материнской молекулы

Синтез двух дочерних цепей ДНК

А. В связи с антипараллельностью цепей ДНК синтез дочерних цепей идет по-разному,на верхней материнской цепи дочерняя цель синтезируется непрерывно-лидирующая цепь, на нижней материнской цепи дочерняя цепь собирается из фрагментов Оказаки - отстающая цепь

Б. Синтез лидирующих цепей в раэнонаправленных вилках происходит на разных цепях материнской ДНК

Для поддержания главных характеристик клетки или организма на протяжении их жизни, а также в ряду поколений наследственный материал должен отличаться устойчивостью к внешним воздействиям или должны существовать механизмы коррекции возникающих в нем изменений. В живой природе используются оба фактора. Третьим фактором является точность копирования нуклеотидных последовательностей материнской ДНК в процессе ее репликации.

По реакционной способности молекулы ДНК относятся к категории химически инертных веществ. Известно, что роль вещества наследственности может выполнять не только ДНК, но и РНК (некоторые вирусы). Считают, что выбор в пользу ДНК обусловлен ее более низкой по сравнению с РНК реакционной способностью.

Рассмотренный выше механизм репликации отличается чрезвычайно высокой точностью воспроизведения структуры ДНК. При удвоении ДНК ошибки возникают в среднем с частотой 1·10 -6 комплементарных пар оснований.

В поддержании высокой точности репликации важная роль принадлежит прежде всего ферменту ДНК-полимеразе. Этот фермент осуществляет отбор необходимых нуклеотидов из числа имеющихся в ядерном соке нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), точное присоединение их к матричной цепи ДНК и включение в растущую дочернюю цепь. Частота включения неправильных нуклеотидов на этой стадии составляет 1·10 -5 пар оснований.

Такие ошибки в работе ДНК-полимеразы связаны с возникновением измененных форм азотистых оснований, которые образуют «незаконные» пары с основаниями материнской цепи. Например, измененная форма цитозина вместо гуанина связывается водородными связями с аденином. В результате в растущую цепь ДНК включается ошибочный нуклеотид. Быстрый переход измененной формы такого основания в обычную нарушает его связывание с матрицей, появляется неспаренный 3"-ОН-конец растущей цепи ДНК. В этой ситуации включается механизм самокоррекции , осуществляемый ДНК-полимеразой (или тесно связанным с ней ферментом - редактирующей эндонуклеазой). Самокоррекция заключается в отщеплении ошибочно включенного в цепь ДНК нуклеотида, не спаренного с матрицей. Следствием самокоррекции является снижение частоты ошибок в 10 раз (с 10 -5 до 10 -6).

Несмотря на эффективность самокоррекции, в ходе репликации после удвоения ДНК в ней обнаруживаются ошибки. Особенно часто это наблюдается при нарушении концентрации четырех нуклеозидтрифосфатов в окружающем субстрате. Значительная часть изменений возникает также в молекулах ДНК в результате спонтанно происходящих процессов, связанных с потерей пуриновых оснований - аденина и гуанина (апуринизацией) - или дезаминированием цитозина, который превращается в урацил. Частота последних изменений достигает 100 на 1 геном/сут.

Содержащиеся в ДНК основания могут изменяться под влиянием реакционноспособных соединений, нарушающих их нормальное спаривание, а также под действием ультрафиолетового излучения, которое может вызвать образование ковалентной связи между двумя соседними остатками тимина в ДНК (димеры тимина). Названные изменения в очередном цикле репликации должны привести либо к выпадению пар оснований в дочерней ДНК, либо к замене одних пар другими. Указанные изменения действительно сопровождают каждый цикл репликации ДНК, однако их частота значительно меньше, чем должна была бы быть. Это объясняется тем, что большинство изменений такого рода устраняется благодаря действию механизма репарации (молекулярного восстановления) исходной нуклеотидной последовательности ДНК.

Механизм репарации основан на наличии в молекуле ДНК двух комплементарных цепей. Искажение последовательности нуклеотидов в одной из них обнаруживается специфическими ферментами. Затем соответствующий участок удаляется и замещается новым, синтезированным на второй комплементарной цепи ДНК. Такую репарацию называют эксцизионной , т.е. с «вырезанием». Она осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют также дорепликативной.

Восстановление исходной структуры ДНК требует участия ряда ферментов. Важным моментом в запуске механизма репарации является обнаружение ошибки в структуре ДНК. Нередко такие ошибки возникают во вновь синтезированной цепи в процессе репликации. Ферменты репарации должны обнаружить именно эту цепь. У многих видов живых организмов вновь синтезированная цепь ДНК отличается от материнской степенью метилирования ее азотистых оснований, которое отстает от синтеза. Репарации при этом подвергается неметилированная цепь. Объектом узнавания ферментами репарации могут также служить разрывы в цепи ДНК. У высших организмов, где синтез ДНК происходит не непрерывно, а отдельными репликонами, вновь синтезируемая цепь ДНК имеет разрывы, что делает возможным ее узнавание. Восстановление структуры ДНК при утрате пуриновых оснований одной из ее цепей предполагает обнаружение дефекта с помощью фермента эндонуклеазы, которая разрывает фосфоэфирную связь в месте повреждения цепи. Затем измененный участок с несколькими примыкающими к нему нуклеотидами удаляется ферментом экзонуклеазой, а на его месте в соответствии с порядком оснований комплементарной цепи образуется правильная нуклеотидная последовательность. При изменении одного из оснований в цепи ДНК в восстановлении исходной структуры принимают участие ферменты ДНК-гликозилазы числом около 20. Они специфически узнают повреждения, обусловленные дезаминированием, алкилированием и другими структурными преобразованиями оснований. Такие модифицированные основания удаляются. Возникают участки, лишенные оснований, которые репарируются, как при утрате пуринов. Если восстановление нормальной структуры не осуществляется, например в случае дезаминирования азотистых оснований, происходит замена одних пар комплементарных оснований другими - пара Ц-Г может заменяться парой Т-А и т.п. Образование в полинуклеотидных цепях под действием УФ-лучей тиминовых димеров (Т-Т) требует участия ферментов, узнающих не отдельные измененные основания, а более протяженные повреждения структуры ДНК. Репаративный процесс в этом случае также связан с удалением участка, несущего димер, и восстановлением нормальной последовательности нуклеотидов путем синтеза на комплементарной цепи ДНК. В том случае, когда система эксцизионной репарации не исправляет изменения, возникшего в одной цепи ДНК, в ходе репликации происходит фиксация этого изменения и оно становится достоянием обеих цепей ДНК. Это приводит к замене одной пары комплементарных нуклеотидов на другую либо к появлению разрывов (брешей) во вновь синтезированной цепи против измененных участков. Восстановление нормальной структуры ДНК при этом может произойти и после репликации.

Пострепликативная репарация осуществляется путем рекомбинации (обмена фрагментами) между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК. Примером такой пострепликативной репарации может служить восстановление нормальной структуры ДНК при возникновении тиминовых димеров (Т-Т), когда они не устраняются самопроизвольно под действием видимого света (световая репарация) или в ходе дорепликативной эксцизионной репарации. Ковалентные связи, возникающие между рядом стоящими остатками тимина, делают их не способными к связыванию с комплементарными нуклеотидами. В результате во вновь синтезируемой цепи ДНК появляются разрывы (бреши), узнаваемые ферментами репарации. Восстановление целостности новой полинуклеотидной цепи одной из дочерних ДНК осуществляется благодаря рекомбинации с соответствующей ей нормальной материнской цепью другой дочерней ДНК. Образовавшийся в материнской цепи пробел заполняется затем путем синтеза на комплементарной ей полинуклеотидной цепи. Проявлением такой пострепликативной репарации, осуществляемой путем рекомбинации между цепями двух дочерних молекул ДНК, можно считать нередко наблюдаемый обмен материалом между сестринскими хроматидами.

В ходе дорепликативной и пострепликативной репарации восстанавливается большая часть повреждений структуры ДНК. Однако, если в наследственном материале клетки возникает слишком много повреждений и часть из них не ликвидируется, включается система индуцируемых (побуждаемых) ферментов репарации (SOS-система ). Эти ферменты заполняют бреши, восстанавливая целостность синтезируемых полинуклеотидных цепей без точного соблюдения принципа комплементарности. Вот почему иногда сами процессы репарации могут служить источником стойких изменений в структуре ДНК (мутаций). Названная реакция также относится к SOS-системе.

Если в клетке, несмотря на осуществляемую репарацию, количество повреждений структуры ДНК остается высоким, в ней блокируются процессы репликации ДНК. Такая клетка не делится, а значит, не передает возникших изменений потомству.

Вызываемая повреждениями ДНК остановка клеточного цикла в сочетании с невозможностью молекулярной репарации измененного наследственного материала может с участием белка, синтез которого контролируется геном р53, приводить к активации процесса самоликвидации (апоптоз ) дефектной клетки с целью устранения ее из организма.

Таким образом, обширный набор различных ферментов репарации осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК, удаляя из нее поврежденные участки и способствуя поддержанию стабильности наследственного материала. Совместное действие ферментов репликации (ДНК-полимераза и редактирующая эндонуклеаза) и ферментов репарации обеспечивает достаточно низкую частоту ошибок в молекулах ДНК, которая поддерживается на уровне 1 · 10 -9 пар измененных нуклеотидов на геном. При размере генома человека 3 · 10 9 нуклеотидных пар это означает появление около 3 ошибок на реплицирующийся геном. Вместе с тем даже этот уровень достаточен для образования за время существования жизни на Земле значительного генетического разнообразия в виде генных мутаций.

Наследственная информация, записанная с помощью генетического кода, хранится в молекулах ДНК и размножается для того, чтобы обеспечить вновь образуемые клетки необходимыми «инструкциями» для их нормального развития и функционирования. Вместе с тем непосредственного участия в жизнеобеспечении клеток ДНК не принимает. Роль посредника, функцией которого является перевод наследственной информации, сохраняемой в ДНК, в рабочую форму, играют рибонуклеиновые кислоты - РНК.

В отличие от молекул ДНК рибонуклеиновые кислоты представлены одной полинуклеотидной цепью, которая состоит из четырех разновидностей нуклеотидов, содержащих сахар, рибозу, фосфат и одно из четырех азотистых оснований - аденин, гуанин, урацил или цитозин. РНК синтезируется на молекулах ДНК при помощи ферментов РНК-полимераз с соблюдением принципа комплементарности и антипараллельности, причем аденину ДНК в РНК комплементарен урацил. Все многообразие РНК, действующих в клетке, можно разделить на три основных вида: м-РНК, т-РНК, р-РНК.

4.5. Транскрипция –перенос информации с молекулы ДНК на молекулу про-и-РНК. Матрицей для синтеза РНК служит одна из двух цепей ДНК.

Для того чтобы синтезировать белки с заданными свойствами, к месту их построения поступает «инструкция» о порядке включения аминокислот в пептидную цепь. Эта инструкция заключена в нуклеотидной последовательности матричных, или информационных РНК (м-РНК, и-РНК), синтезируемых на соответствующих участках ДНК.

4 стадии:

1) Связывание ДНК-зависимой РНК-полимеразы с промотором . Синтез м-РНК начинается с обнаружения РНК-полимеразой особого участка в молекуле ДНК, который указывает место начала транскрипции - промотора .

2) Инициация. После присоединения к промотору РНК-полимераза раскручивает прилежащий виток спирали ДНК. Две цепи ДНК в этом месте расходятся, и на одной из них фермент осуществляет синтез м-РНК. Сборка рибонуклеотидов в цепь происходит с соблюдением их комплементарности нуклеотидам ДНК, а также антипараллельно по отношению к матричной цепи ДНК.

3) Элонгация – рост цепи РНК. В связи с тем, что РНК-полимераза способна собирать полинуклеотид лишь от 5"-конца к 3"-концу, матрицей для транскрипции может служить только одна из двух цепей ДНК, а именно та, которая обращена к ферменту своим 3"-концом (3" → 5"). Такуюцепь называют кодогенной. Антипараллельность соединения двух полинуклеотидных цепей в молекуле ДНК позволяет РНК-полимеразе правильно выбрать матрицу для синтеза м-РНК.

4) Терминация. Продвигаясь вдоль кодогенной цепи ДНК, РНК-полимераза осуществляет постепенное точное переписывание информации до тех пор, пока она не встречает специфическую нуклеотидную последовательность - терминатор транскрипции. В этом участке РНК-полимеразаотделяется как от матрицы ДНК, так и от вновьсинтезированной м-РНК. Фрагмент молекулы ДНК, включающий промотор,транскрибируемую последовательность и терминатор, образует единицу транскрипции - транскриптон.

В процессе синтеза, по мере продвижения РНК-полимеразы вдоль молекулы ДНК, пройденные ею одноцепочечные участки ДНК вновь объединяются в двойную спираль. Образуемая в ходе транскрипции м-РНК содержит точную копию информации, записанной в соответствующем участке ДНК. Тройки рядом стоящих нуклеотидов м-РНК, шифрующие аминокислоты, называют кодонами. Последовательность кодонов м-РНК шифрует последовательность аминокислот в пептидной цепи. Кодонам м-РНК соответствуют определенные аминокислоты.

Схема синтеза мРНК

Общие данные

Как сказано в главе 6, клеточные мембраны в условиях нормального функционирования обеспечивают множество функций. Плазматическая и внутриклеточные мембраны либо функционируют самостоятельно - в основном за счет интегральных белков, находящихся по обе стороны мембраны, либо участвуют в сопряженных с ними функциях клетки (за счет контроля со стороны рецепторных и транспортных белков), а также функциях структурных компонентов клетки, сформированных из других белков, липидов, сахаров и микроэлементов.

В целом повреждения клетки сопровождаются нарушениями происходящих в ней генетических, биохимических и физико-химических процессов и связаны с преобразованиями макро- и микромолекул, включая: полинуклеотиды и нуклеотиды, полипептиды и пептиды, полисахариды и моносахариды, липиды и их компоненты (фосфолипиды, сфинголипиды, жирные кислоты, холестерин), а также перемещениями ионов металлов и других химических соединений, свободных радикалов, электронов, атомных и аттомолярных структур.

Именно поэтому столь велико значение для клетки ее защитных и восстановительных (репарационных) ферментных систем при разного рода повреждениях. Рассмотрим эти системы с учетом приведенных в предыдущих главах пособия данных о структурной организации, причинах и механизмах повреждения клетки, а также данных об основных формах клеточной гибели.

ЗАЩИТНЫЕ И ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ

ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ ОРГАНИЗМА

Как известно, к главным защитным и восстановительным системам организма относятся нервная, эндокринная и иммунная системы (см. главы 13-15). Затем (по значимости) следуют детоксицирующие системы внутренних органов (печень, селезенка, почки),

тканей (кожа и слизистые оболочки) и, наконец, клеточные защитные и восстановительные системы, включая: системы цитохрома Р 450 , глутатионзависимых ферментов, супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, плазмалогенов, пероксидаз и фосфолипаз (в частности, фосфолипидные) и другие системы, связанные с восстановлением структурообразующих компонентов клетки. Отдельного внимания заслуживают многочисленные системы репарации ДНК и пока еще мало изученные ферментные защитные системы биологических жидкостей организма (крови, лимфы, церебральной жидкости, желудочного и кишечного сока). Все эти защитные и восстановительные системы организма основаны на действии генов, объединенных в единые генные сети (см. главу 2).

В первую очередь рассмотрим наиболее известные защитные системы клетки.

Системы детоксикации ксенобиотиков

Системы инактивации (детоксикации) чужеродных для организма веществ или ксенобиотиков, контролируются генами внешней среды, кодирующими синтез многочисленных белков-ферментов, метаболизирующих (деградирующих и детоксицирующих) и выводящих из организма ксенобиотики.

Мутации генов детоксикации нередко обусловливают наследственную предрасположенность к тяжелым заболеваниям, поражающим различные системы организма и отдельные органы. Например, хорошо изучена связь клинических проявлений муковисцидоза, обусловленного мажорной мутацией (CFTR), с состоянием генов системы детоксикации. Основными проявлениями этого заболевания являются тяжелые хронические обтурационные пневмонии, приводящие к преждевременной смерти больных детей, как правило, не доживающих до двадцатилетнего возраста. В свою очередь, мутации самих генов детоксикации нередко предрасполагают к развитию заболеваний легких: бронхиальной астмы, хронического обтурационного бронхита, рака, эмфиземы и другой легочной патологии.

Было также высказано предположение, что и аллельные варианты генов детоксикации могут влиять на клинические проявления при муковисцидозе. Это предположение было подтверждено в работе М.А. Бакай и соавт. (1999). Оказалось, что больные со смешанной формой и тяжелым течением муковисцидоза либо были гомозиготами по «нулевому» аллелю гена глутатионтрансферазы М1 (GSTM1 0/0) -

ферменту второй фазы детоксикации ксенобиотиков, либо имели медленно экспрессирующийся S-аллель гена первой фазы детоксикации - микросомальной эпоксигидролазы (mEPXH).

В этой работе было также отмечено достоверное преобладание гомозиготного состояния по аллелю S (или S/S) в гене mEPXH у больных с хроническими респираторными заболеваниями.

Учитывая четкую корреляцию легочной патологии с «медленным» аллелем гена mEPXH и «нулевым» аллелем гена GSTM1, сделали вывод, что у больных с муковисцидозом, связанным с соответствующим распределением аллелей (mEPXH S/S и GSTM1), легочная патология развивается наиболее часто и протекает особенно неблагоприятно. По этой причине авторы посчитали целесообразным выяснение не только характера мутации в гене муковисцидоза, но и определение у больных случаев носительства неблагоприятных аллелей генов mEPXH S/S и GSTM1. Иными словами, в этой работе показано четкое влияние некоторых аллелей генов DQA1 локуса HLA на тяжесть течения муковисцидоза и хронических респираторных заболеваний.

Детоксикция с помощью цитохрома Р 450

В мембранах ЭР клеток печени, а также других органов и тканей находятся монооксидазные ферментные системы, обеспечивающие биосинтетические и дезинтоксикационные процессы по нейтрализации (трансформации) ксенобиотиков (лекарств и техногенных соединений - прокарциногенов) в первой фазе детоксикации. Эти системы сформированы из гиперсемейств цитохромов Р 450 или монооксигеназ, которые метаболизируют широкий спектр экзогенных и эндогенных субстратов.

По состоянию на январь 2006 г., в геномах человека и животных было идентифицировано 1174 белка и соответствующее количество кодирующих их генов, относящихся к цитохромам Р 450 (Лисица А.В., 2007). При этом количество известных химических соединений, взаимодействующих с ферментами системы цитохрома Р 450 , насчитывало 1708, включая 1223 субстрата, 115 индукторов и 484 ингибитора.

В организме человека выделено около 50 форм цитохромов Р 450 (Helson, 1998), участвующих в реакции монооксигеназного катализа и играющих в ней ведущую роль благодаря способности избирательно связываться с субстратом. Функционирование цитохромов Р 450 определяется их взаимодействием с белками-партнерами. Ферменты цитохрома Р 450 замыкают цепочку переноса электронов и используют полученные редокс-эквиваленты для окисления субстрата. В каче-

стве белков-партнеров цитохрома Р 450 могут быть либо несколько белков, например НАДФН-цитохром Р 450 -редуктаза и цитохром Ь5, а также адренодоксин-редуктаза и адренодоксин, либо это может быть только один белок, например редуктаза.

В числе генов человека, кодирующих ферменты цитохрома Р 450 , был выделен ген ароматазы CYP19, ответственный за синтез фермента, катализирующего переход андрогенов в эстрогены в разных тканях, включая ткань грудной железы. Этот ген имеет 11 полиморфизмов ДНК, связанных с усилением или ослаблением его экспрессии (аллели: ТТТА 7 , ТТТА 11 ТТТА 12 и др).

Другой ген этой системы - ген CYP1A1 кодирует цитохром Р 450 1А1, который метаболизирует углеводороды табачного дыма и также имеет свои полиморфизмы (Т623С, А4489G).

Ген CYP17 кодирует цитохром Р 450 с17альфа. Он участвует в биосинтезе половых стероидов.

Следует отметить, что локализация цитохромов Р 450 в микросомах печени обеспечивает получение ими электронов от белкафлавопротеина (цитохром Р 450 -редуктаза), а сами цитохромы Р 450 являются активной формой белка-гемопротеина. При этом стабильность данного белка обеспечивается липидным бислоем мембраны, состоящим из фосфатидилхолина или смеси микросомальных фосфолипидов.

Установлено, что при взаимодействии цитохрома Р 450 с ксенобиотиком происходит его инактивация, в ходе которой он переходит из активной формы цитохрома Р 420 в неактивную. Кроме того, данная неактивная форма может быть получена при инкубации изолированных микросом печени при температуре 37 °С.

В реакциях «ксенобиотик-цитохром Р 450 » все ксенобиотики выступают в роли либо экзогенных субстратов (канцерогены, лекарства, пищевые добавки, токсины, яды), либо эндогенных субстратов (жирные кислоты, простагландины, стероиды, холестерин). Молекулы этих субстратов связываются в мембранах ЭР с молекулами цитохрома Р 450 , вызывают цепь реакций ПОЛ и другие изменения. При этом они могут действовать как прямо, так и опосредованно. Во втором случае среди них выделяют облигатные и факультативные ксенобиотики.

Облигатные ксенобиотики, например фенобарбитал, оказывают прямое токсическое действие на гепатоциты (эффект зависит от дозы), что ведет к гепатомегалии за счет индукции печеночных ферментов.

В свою очередь, ксенобиотик кортизон вызывает жировую инфильтрацию печени или стеатоз в результате трансформации в высокотоксичные промежуточные соединения, например салицилаты и полициклические углеводороды.

Кроме того, прямое действие облигатных ксенобиотиков или их метаболитов вызывает нарушение обмена билирубина (на всех этапах его синтеза от гема до экскреции в желчные протоки), дилатацию синусоидов и окклюзию вен печени, что ведет к некрозу и реже к апоптозу клеток печени.

Факультативные ксенобиотики вызывают иммуно-опосредованные реакции, лежащие в основе идиосинкразии или непереносимости соединений, например аллергические реакции на лекарства.

Молекула самого цитохрома Р 450 поражается за счет двух механизмов повреждения: непосредственно белка свободными радикалами и липидного окружения белка в мембране.

В целом механизм детоксикации ксенобиотиков в печени с участием цитохрома Р 450 включает три фазы.

Первая фаза - контакт ксенобиотика с ферментами ЭР (микросомальная фракция гепатоцитов), монооксигеназами, цитохром с-редуктазами, восстановленным НАДФ (в качестве кофактора) и цитохромом Р 450. Во время контакта происходит модификация ксенобиотика с формированием (освобождением) функциональных групп.

Вторая фаза - биотрансформация или конъюгация (соединение) молекулы ксенобиотика с эндогенными молекулами при участии двух ферментов: UDP-глюкуронилтрансферазы и глутатион-S- трансферазы, обеспечивающих детоксикацию или снижение токсичности с ускоренным выведением ксенобиотика (см. ниже). В этой фазе микросомальная глутатион^-трансфераза непосредственно связана с молекулой цитохрома Р 450 , что способствует быстрой инактивации промежуточных продуктов метаболизма или реакционных метаболитов ксенобиотика.

Третья фаза - активный транспорт и экскреция (эвакуация) трансформированных с помощью цитохрома Р 450 продуктов ксенобиотика с желчью и мочой.

Таким образом, инактивация цитохрома Р 450 - это показатель повреждения мембран ЭР в печени. Вместе с тем, по скорости инактивации цитохрома Р 450 можно судить о восстановлении или репарации поврежденных мембран клетки.

Детоксикация гидроперекисей фосфолипидов

К системе детоксикации гидроперекисей фосфолипидов (LOOH) относятся три глутатионзависимых комплекса ферментов, осуществляющих двухэлектронное восстановление LOOH: глутатионпероксидаза, фосфолипид-пероксид-глутатион-пероксидаза, а также селеннесодержащая глутатион-трансфераза, тип альфа (-SH-S-) или GST-комплекс. Эти ферментные комплексы относятся к антиоксидантам - хинолам (енолам), присутствуют во всех клетках, тканях и органах, осуществляют взаимодействие с витаминами Е, С и убихинолом (кофермент Q) и являются универсальными системами для связывания активных метаболитов. Все три глутатионзависимые антиоксидантные системы относятся к ферментной редокс-системе глутатиона (ФРСГ), которая участвует в ПОЛ и пролиферации иммунокомпетентных клеток. ФРСГ контролирует деление и активность прооксидантов, угнетает свободно-радикальные стадии перекисного окисления, разрушает (нерадикальным путем) перекиси и взаимодействует с неперекисными продуктами перекисного окисления.

Свойства редокс-системы определяются состоянием баланса: «окисление- восстановление» (см. главу 9).

Уровень активности глутатионзависимых ферментов в разных клетках и тканях отражает состояние всей антиоксидантной системы, так как эти ферменты необходимы для защиты от агрессии АФК, цепных свободно-радикальных реакций и усиления процессов

Индукция глутатионзависимых ферментов характеризуется «избыточностью» их активности и сбалансированностью по отношению к оксигенации клеток, тканей и органов.

Особая роль принадлежит GST-комплексу, включающему 21 фермент, из которых истинно цитозольными являются 16. Они сгруппированы в 6 подсемейств (классов): альфа, мю, омега, пи, тета и дзета. Каждый класс - это димер, состоящий из двух равных или разных субъединиц (с собственными активными центрами), которые действуют независимо друг от друга. В каждой субъединице 2 домена, связанных короткой линкерной цепочкой из 6 аминокислотных остатков.

Каждый из шести классов ферментов кодируется кластерами генов.

Класс альфа - кластер генов расположен в локусе 6р12, содержащем гены GSTA1, GSTA2, GSTA3, GSTA4 и GSTA5 и 7 псевдоге-

нов. Гены этого класса участвуют в обмене билирубина, гема и стероидных гормонов. Гены GSTA1 и GSTA2 экспрессируются во всех тканях. Ген GSTA3 выделен из 8-9-недельной плаценты. Ген GSTA5 из тканей не выделен.

Класс мю - кластер картирован в локусе 1р13.3. Включает 5 генов: ген GSTM1 (представлен тремя аллельными вариантами: А, В и О; экспрессируется в клетках печени и крови); ген GSTM2 (только в мышцах); гены GSTM3 и GSTM4 (тестикулы и мозг); ген GSTM5 (легкие, мозг, сердце, тестикулы), а также 2 псевдогена.

Класс омега - кластер состоит из двух генов, картированных в локусе 10q25.1. Из них ген GSTO1 кодирует уникальный фермент «домашнего хозяйства«, удаляющий S-тиоловые радикалы, образующиеся в ответ на оксидантный стресс. Второй ген - это GSTO2 (мало изучен). Транскрипты этих генов широко представлены во всех тканях. Максимальная их экспрессия наблюдается в печени, скелетных мышцах и сердце; минимальная экспрессия характерна для легких, мозга и плаценты.

Класс пи - представлен одним геном GSTP1, картированным в локусе 11q13, и псевдогеном GSTPP, картированным в локусе 12q13-q14. Ген GSTP1 имеет 3 аллельных варианта, связанных с полиморфизмом нуклеотидных последовательностей в кодонах 105 и 114, относящихся к активным центрам ферментов. Этот ген является ингибитором протеинкиназ, участвующих в клеточной пролиферации и апоптозе.

Класс тета - его кластер включает 2 гена (GSTT1 и GSTT2), картированных в локусе 22q11.23. Ген GSTT1 существует в двух аллельных вариантах (активном и нулевом). Ген GSTT2 мало изучен.

Класс дзета - представлен одним геном GSTZ1, картированным в локусе 14q24.3. Ген экспрессируется в клетках печени и в меньшей степени - в клетках скелетных мышц и тканей мозга. Участвует в обмене фенилаланина и тирозина.

Следует отметить, что ферменты GST-комплекса, синтезируемые всеми указанными классами генов, функционируют на основе многочисленных механизмов, среди которых:

Каталитическая инактивация ксенобиотика через его соединение с глутатионом или путь замещения по электрофильным атомам углерода (галоген и нитроалканы), азота (тринитроглицерин), серы (тиоцианаты и дисульфиты) и фосфора (метилпаратионин);

Некаталитическая конъюгация (связывание) с субстратом; классическим субстратом считается 1-хлоро-2,4-динитробензол; этот путь также характерен для конъюгации оксиаренов, эпоксидов алкенов, ионов нитрония и карбония, а также свободных радикалов;

Восстановление органических гидроперекисей (липид- и ДНКгидрококсипероксиды) до спиртов через экспрессию активности GSH-пероксидазы или восстановленного глутамина;

Изомеризация простагландинов и стероидов;

Участие в метаболизме других экзогенных соединений.

Восстановленный глутатион (GSH) относится к низкомолекулярным тиолам, доминирующим в большинстве пролиферирующих клеток. Этот трипептид (L-гамма-глутамил-L-цистеинилглицин) участвует в глутамильном цикле и обезвреживает различные токсические соединения путем их преобразования в тиоэфиры (при этом атакуются атомы азота, кислорода, серы и углерода). В ходе дальнейшего метаболизма глутатионовые конъюгаты переходят в меркаптуровые кислоты (меркаптаны) и выводятся из организма (со скоростью около 0,1 ммоль в сутки).

Значение GSH можно проследить у онкологических больных, у которых концентрация свободного глутамина зависит от свойств цитостатиков, которые истощают его запас, вызывая лизис опухолевых клеток. Кроме того, при пролиферации клеток и опухолевом росте снижение концентрации тиолов и дисульфитов зависит от поддержания баланса метаболизма, синтеза глутатионзависимых ферментов и удаления гидроперекисей фосфолипидов.

Детоксикация LOOH протекает по схемам, предусматривающим действие:

Пероксид-Са 2 +-стимулируемой PLA 2 и глутатион-пероксидазы по пути «гидролиз-восстановление-репарация»;

ФЛ-пероксид-глутатион-пероксидазы и фосфолипазы А 2 по пути «восстановление-гидролиз-репарация».

Обе схемы ведут к реацилированию лизофосфолипидов.

Вместе с тем, в условиях дисбаланса между эндогенными оксидантами и антиоксидантами может возникнуть избыток АФК и последующий за ним окислительный стресс. Механизм такого стресса, именуемого «окислительно-стрессорным сигналингом», сопровождает реакции ПОЛ в ответ на угрожающе высокий или низкий уровень оксидантов.

Окислительно-стрессорный сигналинг

С помощью окислительно-стрессорного сигналинга (ОСС) клетка продуцирует избыток антиоксидантов и активирует один или сразу несколько классов ферментов: восстановленный глутатион (см. выше), гемоксигеназу-1, глутатионпероксидазу, каталазу, СОД и ферритин.

Показано, что ОСС стимулирует экспрессию генов, контролирующих апоптоз, цитопротекцию и другие клеточные эффекты.

В ОСС участвуют протеинкиназа С (ПК С),МАРК, гидролазы, а также фосфолипазы С (PL C) и А 2 (PLA 2), активируемые ионами Са 2 +. Ранними медиаторами этих ферментов служат LOOH (см. выше), считающиеся «миметиками» эффектов факторов роста (TNF-альфа), цитокинов и других агонистов, что указывает на роль оксидантных производных как вторичных мессенджеров (см. главу 8).

Например, оксидантная активация фосфолипаз через высвобождение арахидоновой кислоты инициирует образование эйкозаноидных липидных медиаторов и лизофосфолипидов, выступающих в роли соединений, дающих прямые эффекты либо метаболизирующихся до PAF и других эффекторов.

После действия оксидантов, которые особенно сильно повреждают клеточные мембраны, судьба клетки двояка: либо выживание, либо гибель через апоптоз или некроз - это зависит от выраженности «окислительного стресса». Например, с помощью эндоили экзогенных пероксидов можно запустить апоптоз в лейкемических клетках. Возможен также механизм активации под действием цитозольной фосфолипазы (см. главу 9), влияющей на арахидоноил-фосфолипиды, включающий катализируемое ПКС фосфорилирование фермента и его транслокацию в мембране (через активацию МАРК). Этот механизм мало зависит от Са 2+ и, следовательно, включается только при относительно низком уровне ПОЛ.

Система супероксиддисмутазы

Фермент СОД катализирует реакцию взаимодействия двух супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода (Н 2 О 2) и молекулярного кислорода (О 2). Эта реакция получила название реакции дисмутации (см. главы 6 и 9).

Ген СОД 1 локализован на хромосоме 21, и такая его локализация многократно обсуждалась в литературе для объяснения причин и механизмов развития синдрома Дауна (как тройная доза гена). Однако это не было подтверждено. Оказалось, что в митохондриях нормальных клеток, служащих источником АТФ и АФК, допустимый

уровень последних поддерживается защитной ферментной системой, включающей наряду с СОД еще и цитохромоксидазу, глутатионпероксидазу и некоторые другие ферменты.

Антиоксидантная роль крови

Как отмечено в главах 8 и 9, в регуляции активности мембранных ферментов важную роль играют механизмы сигнализации. Большая часть этих механизмов реализуется через кровь, которая обладает собственной антиоксидазной активностью и непосредственно контактирует со структурными компонентами стенок кровеносных сосудов, в основном представленных эндотелиальными клетками.

Регуляцию активности ферментов с помощью структурнофункциональных элементов крови можно продемонстрировать на примере «тканевого фактора», или трансмембранного гликопротеина, обнаруженного при атеросклерозе в адвентиции кровеносных сосудов и внутренней области атеросклеротической бляшки. Этот фактор экспрессируется на мембранах моноцитов и макрофагов и участвует в воспалении и дестабилизации бляшки; он особенно чувствителен к действию ингибиторов, синтезируемых эндотелиальными клетками кровеносных сосудов в ходе сигнализации.

Важно отметить, что через кровь транспортируется кислород, осуществляется бактерицидное действие фагоцитов, перемещаются ионы металлов переменной валентности, являющиеся катализаторами или ингибиторами процессов окисления-восстановления. Вместе с тем, кровь в определенной мере является лимитирующим звеном системы антиоксидантной защиты, так как по сравнению с внутриклеточным содержимым в ней мало высокомолекулярных антиоксидантов, что способствует усилению окислительных реакций и не благоприятствует восстановительным реакциям.

Механизмы восстановления клеточных мембран

Биохимиками давно высказано предположение об адаптации клеточных мембран к повреждениям. В пользу этого, например, свидетельствуют данные о восстановительной работе ферментов за счет реакций, осуществляемых ПК С, МАРК и митохондриальными АТР-зависимыми кальциевыми каналами. В частности, открытие кальциевых каналов в мембранах митохондрий вызывает их деполяризацию, снижая избыточное накопление Са 2+ .

Именно такой механизм способствует регенерации клеток при инфаркте миокарда.

Экспериментальным путем показано восстановление активности ферментов in vitro поврежденных мембран микросом в печени крыс при добавлении к ним ФХ или смеси ФХ и лизоФХ. Добавление этих фосфолипидов восстанавливало активность глюкозо-6-фосфатазы, Са 2 +-, Na+-, K+-ATPаз, стеароил-КоА-десатуразы, липазы, UDP- глюкуронилтрансферазы, фенилаланингидроксилазы, цитохром Ь5 -редуктазы.

Схожие результаты были получены для сфингомиелиназ мозга, бета-оксибутиратдегидрогеназы митохондрий сердца и ацетилхолинэстеразы эритроцитов быка.

В связи с этими данными было предположено, что восстановление фосфолипидами активности мембранных белков носит неспецифический характер, так как у большинства ферментов нет потребности в определенных типах фосфолипидов, и поэтому восстановительную функцию могут выполнять для них разные типы последних (или их смеси).

Интересен уже сам факт участия мембранных фосфолипидов в восстановлении активности белков-ферментов. Вместе с тем, для сохранения (а возможно, и для восстановления) активности мембранных ферментов важным является жирнокислотный состав фосфолипидов, добавляемых в клетки. Например, это было показано для Са 2 +-АТРазы саркоплазматического ретикулума, когда замена собственных фосфолипидов на ДПФХ (фосфатидилхолин с высоким содержанием насыщенных жирных кислот) в 8 раз снижала активность по сравнению с частично делипидированным ферментом, а при замене собственных фосфолипидов на диолеил-ФХ скорость реакции, наоборот, резко возрастала.

Кроме того, отмечено значение высокой подвижности углеводородных цепей фосфолипидов для восстановления активности ферментов и наличия на мембранах определенного поверхностного заряда.

Схожие результаты были получены в отношении:

Кислых фосфолипидов (ФС, ФИ и ФК) при их действии на фосфатазу миозина гортани;

Анионных фосфолипидов (ФС) - при действии на 5-монодегидрогеназу плаценты человека.

Таким образом, в настоящее время можно говорить о бесконечном многообразии и значении еще не открытых, но, по-видимому, реально существующих механизмов восстановления структурных и функциональных нарушений клеточных мембран.

Ингибиторы мутагенеза

Как сказано в главе 5, мутагенез - это процесс образования мутаций в наследственном материале, индуцированный действием различных мутагенных факторов.

Еще в середине XX в. А. Новик и Л. Сцилард показали, что апуриновые рибонуклеозиды снижают уровень спонтанных и индуцированных мутаций у E. coli, что позволило им выделить новый класс химических соединений, получивших название антимутагенов.

В конце XX в. С де Флора и С. Рэмел разделили антимутагены на два класса: внеклеточные (дисмутагены) и внутриклеточные.

Внеклеточные антимутагены включают три подгруппы.

Ингибиторы поглощения антимутагенов и их предшественников (ароматические аминокислоты, жирные кислоты и др.). Они препятствуют проникновению и ускоряют выведение из организма мутагенов.

Ингибиторы эндогенного формирования мутагенов (аскорбиновая кислота, токоферол, фенолы, ферментированные молочные продукты). Они предотвращают или тормозят реакции нитрозирования или изменяют внутрикишечную флору.

Дезактиваторы мутагенов в результате физических и/или химических реакций (антиоксиданты, вещества, поддерживающие уровень рН в биологических жидкостях, и тиолы).

Внутриклеточные антимутагены также включают три подгруппы.

Модуляторы метаболизма (тиолы и фенолы). Они ускоряют переход мутагенов в клетки, не являющиеся мишенями, и индуцируют механизм детоксикации.

Инактиваторы реакционноспособных молекул. Они взаимодействуют с электрофилами, защищают нуклеофильные участки ДНК, улавливают кислородные радикалы.

Модуляторы репликации и репарации ДНК (арсенит натрия, ванилин, ингибиторы протеаз, кумарин, тиолы, хлорид кобальта). Они увеличивают точность репликации, повышают эффективность репарации, ингибируют ошибки репарации.

Как следует из этой классификации, одно и то же соединение может относиться к нескольким группам, например тиолы.

Помимо внеклеточных и внутриклеточных антимутагенов, Б. Ставрик выделил в 1992 г. из разных типов пищевых продуктов более 25 содержащихся в них антимутагенов или химиопревентеров. В эту группу вошли витамины, жирные кислоты, кальций, кароти-

ноиды, кумарины, пищевые волокна, растительные кислоты, селен, флавоноиды и хлорофилл.

К антимутагенам растительного происхождения относятся зеленый перец, капуста, листья мяты, лук, семена растений, яблоки.

Действие антимутагенов специфично: оно проявляется с высокой избирательностью и зависит от дозы. При этом одни антимутагены могут быть ингибиторами мутагенов, оказывать противоположное комутагенное действие, либо их действие может вообще не проявиться. В частности, к таким антимутагенам относятся витамины С,

Не исключена возможность защиты с помощью антимутагенов клеток одних тканей с одновременным потенцированием мутагеннных эффектов в клетках других тканей.

В целом вопрос об эффективности экзогенных и эндогенных корректоров мутагенеза до сих пор остается открытым.

В связи с этим перейдем к рассмотрению более известных и широко обсуждаемых в научной и учебной литературе восстановительных механизмов в поврежденной клетке.

Восстановление структуры ДНК с помощью механизмов репарации

Как известно, клетки обладают восстановительной способностью или способностью исправлять и устранять (репарировать) повреждения молекулы ДНК, восстанавливая ее исходную структуру. Благодаря этому лишь ограниченное число мутаций сохраняется в процессе репликации, транскрипции и трансляции.

Вместе с тем, если мутация не распознана, извращенная информация транскрибируется в мРНК и экспрессируется в форме неполноценного протеина. Последствия такого события для клетки часто бывают несущественными, но иногда они крайне нежелательны, и это зависит от функций, выполняемых неполноценным протеином.

В настоящее время хорошо изучены многочисленные репарационные механизмы как известные со времен классической генетики (фотореактивация, репарация тиминовых димеров; эксцизионная репарация; SOS-репарация), так и открытые в последние годы (см. ниже).

Обобщив особенности этих механизмов, можно заключить, что репарация разного рода повреждений в молекуле ДНК идет в несколько этапов:

первый этап - это идентификация повреждения и определение его типа;

второй этап - это активация ферментов, которые или напрямую преобразуют повреждение до исходного состояния, или (если прямое восстановление невозможно) вырезают поврежденный участок, формируя брешь.

В последнем случае прибавляются еще два этапа:

третий этап - это синтез нового участка молекулы ДНК (взамен поврежденного);

четвертый этап - это встраивание нового участка в брешь.

Фотореактивация или репарация тиминовых димеров

Под действием УФО в молекуле ДНК может произойти ковалентное сшивание двух рядом стоящих пиримидинов (двух тиминов), находящихся в разных нитях молекулы. При этом образуются тиминовые димеры (циклобутановое кольцо), блокирующие репликацию ДНК. В ходе репарации тиминовых димеров «узнающий» их фермент - фотолиаза соединяется с ними, образуя единый комплекс. УФО активирует этот фермент, и циклобутановое кольцо разрывается с образованием двух отдельно стоящих тиминов. Данный механизм А. Кельнер в 1949 г. назвал фотореактивацией.

Дезаминирование (метилирование) и репарация ошибочно спаренных оснований

Как сказано в главе 6, в ходе дезаминирования аденин превращается в гипоксантин, который образует водородные связи с цитозином. Гуанин преобразуется в ксантин, который образует водородные связи с тимином. Тимин не может быть дезаминирован (единственное азотистое основание в ДНК). При метаболизме цитозина образуется урацил. Если процессы дезаминирования этих азотистых оснований нарушаются, в молекуле ДНК появляются ошибочно или неправильно спаренные основания. Так, вместо АТ-пар в цепи ДНК образуются ГТ-пары, а вместо ГЦ-пар образуются ГА-пары - это ошибки спаривания. Они устраняются с помощью двух механизмов: ГТ-мисмэтчрепарации и ГА-мисмэтч-репарации соответственно. Участниками этих механизмов репарации могут быть:

Белковые продукты четырех генов семейства Mut: H, L, S и U;

Белки-хеликазы;

ДНК-полимеразы, обладающие свойством «делать шаг назад» после постановки очередного нуклеотида в растущую нить ДНК и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду в матричной цепи ДНК, т.е. способные корректиро-

вать ошибки спаривания;

Аденозинтрифосфатазы (ATP);

Дезоксинуклеотидфосфатазы (dNTP).

Следует отметить, что механизмы мисмэтч-репарации оперируют на дочерней нити и производят замену некомплементарных оснований только в ней.

Вскоре после окончания репликации ферменты-метилазы присоединяют метильные группы к аденинам в последовательностях ГАТЦ (гуанин-аденин-тимин-цитозин).

Во время следующей репликации нити ДНК оказываются различимыми: материнская нить содержит метилированные аденины, а в дочерних нитях до окончания репликации аденины еще не метилированы. Их метилирование начнется только после окончания репликации. Поэтому пока аденины не метилированы, клетки должны успеть «отрепарировать» мисмэтчи. Репарация неправильно спаренных оснований может происходить в ходе дезаминирования ДНК, когда фермент N-гликозилаза узнает такое основание, разрывает ковалентную N-гликозидную связь и удаляет его. Кроме того, мисмэтч-репарация может проводиться в ходе метилирования ДНК (см. главу 7).

Если образование классических «уотсон-криковских» пар оснований вообще затруднено, то во время репликации могут происходить ошибки спаривания (ошибки репликации) и также возникают мисмэтчи. Для их устранения привлекаются уже другие ферменты: сначала эндонуклеаза разрывает одну цепь ДНК в местах, где не успели сформироваться АТили ГЦ-пары, затем фосфодиэстераза отщепляет в этих местах разрывов те сахаро-фосфатные группы (АП-сайты), к которым не присоединены основания. Появившиеся в цепочке молекулы бреши (размером в один нуклеотид) застраиваются ДНК-полимеразой I, после чего фермент-лигаза сшивает концы ДНК, восстанавливая исходное состояние молекулы.

Алкилирование и репарация О 6 -алкилированного (метилированного) гуанина и О 4 -алкилированного тимина

Алкилирование - это добавление алкильных боковых групп (метиловые, этиловые, пропиловые или бутиловые) в пуриновые или пиримидиновые основания молекулы ДНК под действием ряда химических мутагенов (алкилирующих агентов). Например, метилнитрозо-гуанит алкилирует (метилирует) гуанин, присоединяя к нему метиловую группу.

В ходе репарации О 6 -алкилированного гуанина (О 6 меГ) метиловая группа отщепляется от гуанина благодаря кислороду, связанному с шестым атомом, и в этой точке происходит восстановление структуры ДНК. Этот механизм был открыт И.А. Рапопортом в 1944 г.

Как установлено, в ходе алкилирования в клетках синтезируются белки - метилтрансферазы, которые захватывают у модифицированного гуанина его метиловые группы, восстанавливая исходную структуру ДНК. Причем метилтрансферазы, захватившие такие группы, уже не могут от них избавиться, что свидетельствует о том, что они не относятся к классу ферментов, которые не изменяются в ходе многочисленных реакций. Кроме этого механизма выделена репарация О 4 -алкилированного тимина (О 4 -алТ). Следовательно, если допустить, что для каждого акта прямой репарации ДНК нужны новые белковые молекулы, то в случае повреждения алкилирующими агентами клетка вынуждена организовать их синтез в соотношении: одна молекула на одно повреждение. Поэтому процессы образования повреждений ДНК и их репарации взаимосвязаны. Как правило, внутри клетки накапливаются тысячи таких молекул. Например, за один клеточный цикл, протекающий у кишечной палочки в течение 30 мин, может накопиться около 3000 метилтрансфераз, способных нейтрализовать 3000 повреждений ДНК.

Апуринизация и эксцизионная репарация

Апуринизация - это образование АП-сайтов в нуклеотидной цепи

Как известно, каждая соматическая клетка при функционировании теряет за сутки примерно 10 тыс. пуринов и пиримидинов, и в результате в ее молекуле ДНК образуются апуриновые сайты или сахарофосфатные группы без оснований (АП-сайты). Если бы АП-сайты не исправлялись, то произошла бы катастрофа.

В ходе устранения АП-сайтов ферменты-инсертазы разрывают ковалентную N-гликозидную связь между основанием и дезоксирибозой, и после этого осуществляется прямая вставка пуринов. Этот механизм открыт Т. Линдалом в 1979 г.

Причины апуринизации: повышение температуры, изменение рН, ионизирующее излучение.

Если клетка не справляется с повреждениями оснований и нуклеотидов в молекуле ДНК с помощью перечисленных выше восстановительных механизмов, тогда в дело вступают более сложные механизмы репарации, одним из которых служит эксцизионная репарация,

осуществляемая путем вырезания (эксцизии) поврежденного основания в нуклеотиде или более протяженного участка молекулы.

Эксцизионная репарация поврежденных оснований происходит с помощью ДНК-гликозилаз, которые узнают повреждения оснований, возникающие при метилировании, окислении, восстановлении, дезаминировании, присоединении формидных групп и других реакциях.

Семейство ДНК-гликозилаз включает 11 типов ферментов, соединяющихся с субстратами или поврежденными мишенями: ura- (содержит урацил); hmu-(оксиметилурацил); 5-tС-(метилцитозин); Hx-(гипоксантин); 3ntA-, тип I (3-метиладенин) и тип II (содержит метиладенин, 7-метилгуанин или 3-метилгуанин); FaPy-(остатки формидопиримидинов или 8-оксигуанина); 5, 6-HT или эндонуклеаза III (5,6 гидратированные остатки тимина); PD-(димеры пиримидинов); тиминовый мисмэтч (содержит некомплементарную ГТ-пару оснований); субстрат mutY (содержит некомплементарную ГА-пару).

ДНК-гликозилазы присоединяются к повреждениям, рвут гликозидные связи между модифицированным основанием и дезоксирибозой, за счет чего образуются АП-сайты.

Образовавшиеся АП-сайты распознаются ферментом АП-эндонуклеазой (способна разорвать цепь внутри молекулы ДНК или РНК). После появления разрыва вступает в действие фермент фосфодиэстераза, которая отщепляет от ДНК ту сахарофосфатную группу, к которой уже не присоединено основание.

В результате появляется брешь в одной цепи ДНК размером в один нуклеотид. Напротив бреши в противоположной цепи ДНК расположен неповрежденный нуклеотид, и уже другой фермент (ДНКполимераза I) вставляет в брешь комплементарный ему нуклеотид, присоединяя его к свободному 3" ОН-концу. Этот конец нити ДНК и ранее образовавшийся при разрыве нити 5"-конец соединяются между собой под действием полинуклеотидлигазы. После этого вся структура считается полностью восстановленной: удалено неправильное основание, вырезан сахарофосфат, к которому было присоединено это основание, брешь заполнена правильным нуклеотидом и однонитевой разрыв восстановлен.

Эксцизионная репарация поврежденных нуклеотидов

Механизм эксцизионной репарации является более сложным и более энергозатратным механизмом, связанным с вырезанием не просто поврежденного основания, а значительного участка цепи

ДНК перед повреждением и после него. У кишечной палочки такую репарацию осуществляет мультиферментный комплекс из эндонуклеаз, кодируемых тремя генами ультрафиолетовой репарации или генами uvr (A, B и С) и называемый комплексом - эксцинуклеаза (рис. 50). Этот механизм был описан Р. Сетлоу и В.Н. Сойфером в 1970 г. Он включает следующие этапы:

Распознавание повреждения белками uvr A и B;

Изгиб молекулы ДНК и изменение конформации белка uvr В;

Внесение двух однонитевых надрезов ДНК с обеих сторон от повреждения с помощью белков uvr В и С;

Расплетение ДНК в участке между двумя надрезами с помощью белка uvr D (хеликаза II);

Отсоединение содержащего дефект фрагмента длиной 12 нуклеотидов (12-мер) с образованием бреши, при этом расходуется энергия одной молекулы АТФ;

Застройка образовавшейся бреши с помощью ДНК-полимеразы;

Соединение свободных концов сахарофосфатного остова ДНК с помощью ДНК-лигазы.

Аналогичный механизм существует у человека. Вместе с тем, у него комплекс эксцинуклеазы состоит из 17 белков, застройка бреши

Рис. 50. Механизм эксцизионной репарации у E.Coli. (по Эллиот В., Эллиот Д., 2002)

идет с участием ДНК-полимераз ОиЕ, а участок, вырезаемый из поврежденной цепи ДНК, имеет длину 29 нуклеотидов (вместо 12 у кишечной палочки).

Репарация поврежденных нуклеотидов включает мисмэтчрепарацию или репарацию, некомплементарных (неканонических) или не «уотсон-криковских» пар оснований - это так называемая репарация ошибочно спаренных оснований (см. выше).

Репарация однонитевых и двухнитевых разрывов ДНК

Помимо рассмотренных выше механизмов репарации известны механизмы восстановления однонитевых разрывов (разрывы связей между основаниями в одной нити молекулы ДНК) и двухнитевых разрывов (разрывы связей между основаниями в двух нитях молекулы ДНК).

Репарация однонитевых разрывов ДНК

Репарация однонитевых разрывов ДНК - эта прямая репарация. Она вызывается в ответ на действие ионизируюущей радиации и обеспечивается последовательным действием ферментов: 3"-фосфодиэстеразы, ДНК-полимеразы-b и ДНК-лигазы (ДНКполинуклеотидлигазы). Восстановление такого разрыва идет с использованием в качестве матрицы неповрежденной комплементарной цепочки ДНК.

Репарация двухнитевых разрывов ДНК

Двухнитевые разрывы молекулы ДНК являются самым опасным для клетки типом повреждений ДНК. Они, как правило, приводят к развитию генетической нестабильности, появлению точковых мутаций и хромосомных аберраций и последующей гибели клеток.

Известны два механизма репарации двухнитевых разрывов ДНК: негомологичное воссоединение разорванных концов и гомологичная рекомбинация.

Негомологичное воссоединение разорванных концов ДНК

Негомологичное воссоединение разорванных концов ДНК происходит между концами молекулы, которые имеют негомологичные последовательности нуклеотидов разной длины или очень короткие гомологичные участки. Этот механизм репарации не безошибочен и часто служит источником точковых мутаций, так как восстановление исходной структуры молекулы ДНК возможно только при воссоединении концов одной и той же нити. Если же это условие не соблюдается, то формируются хромосомные аберрации: делеции, дупликации,

инверсии, инсерции и транслокации (см. главу 5). У млекопитающих негомологичное воссоединение происходит с участием белка Rad50, родственных ему белков, факторов Ku, ДНК-лигазы IV и факторов сайленсинга.

Гомологичная рекомбинация

Механизм гомологичной рекомбинации был изучен у Drosophila melanogaster. Предполагается, что он должен существовать в клетках человека, однако убедительных доказательств этого до сих пор не получено. Считается, что в ходе гомологичной рекомбинации на одной из нитей ДНК образуется брешь, по размеру равная удаляемому у бактерий элементу (Р-элемент). Восстановление бреши происходит с участием копии P-элемента, находящейся на сестринской хроматиде и используемой в качестве матрицы для репаративного синтеза.

Вместе с тем, во время репликации возможно образование одноцепочечной бреши напротив нерепарированного участка, и эта ситуация не может быть исправлена безошибочно без привлечения другой молекулы ДНК.

Поэтому данный механизм обеспечивает восстановление только в тех случаях, когда повреждены обе цепи ДНК.

Белки Альбертса и их роль в репликации и репарации ДНК

В 1968 г. были обнаружены белки Альбертса, или белки SSB, принимающие участие в репарации ДНК. Эти белки благодаря организации их третичной структуры обладают способностью электростатически связываться с ДНК. Белки SSB содержат кластер положительно заряженных аминокислотных остатков, но при этом их общий заряд остается отрицательным, благодаря чему они имеют повышенное сродство к одноцепочечной ДНК.

Если при нарушениях вторичной структуры двухцепочечной ДНК в отдельных нитях ее спирали образуются «расплавленные участки», то белки Альбертса связываются с ними, легко на них садятся и их «выпрямляют». При этом белки SSB, сидящие на комплементарных цепях молекулы, не дают им «схлопнуться», так как за счет электростатических взаимодействий они имеют мощный отрицательный заряд, проявляя сродство друг к другу и покрывая «расплавленный участок» сплошным слоем - это стехиометрическое количество белка. Иными словами, эти белки не денатурируют молекулу ДНК, а лишь фиксируют ее одноцепочечное состояние.

Участие белков SSB в репликации молекулы ДНК абсолютно необходимо для клетки: они удерживают в репликативной вилке в одноцепочечном состоянии обе матричные нити, защищая каждую нить от действия нуклеаз и избирательно стимулируя работу ДНКполимеразы (РНК-полимераза не использует одноцепочечную ДНК, покрытую SSB).

Таким образом, роль белков SSB в репарации одно- и двухнитевых разрывов ДНК сегодня вполне доказана.

Пострепликативная (рекомбинационная) репарация ДНК

В 1968 г. У. Рапп и П. Ховард-Фландерс обнаружили у обработанных УФО бактерий пострепликативную репарацию или рекомбинационную репарацию матричной нити ДНК, в которой содержалось множество невырезанных димеров тимина, и в момент, когда ДНКполимераза, ведущая репликацию, доходила до первого димера, она «застывала» в этой точке на 10 с, затем перебиралась за димер тимина (каким-то непонятным образом) и возобновляла синтез позади дефекта до тех пор, пока не «натыкалась» на очередной димер. Таким образом, участки дочерней нити содержали бреши (неудвоенные при синтезе ДНК), а в участках матричной нити напротив брешей сохранялись незалеченные дефекты. Затем следовала пострепликативная репарация поврежденных участков, в которой принимали участие белки rec A, лигазы и ДНК-полимеразы. Этот механизм напоминал механизм рекомбинации: сначала молекула белка rec A присоединялась к зоне бреши, где под его контролем происходила рекомбинация, в ходе которой участок комплементарной цепи сестринской нити переносился в зону бреши, брешь застраивалась в ходе репликативного синтеза, и лигаза соединяла концы новой и старой нитей молекулы.

SOS-репарация ДНК

SOS-репарация ДНК - это последняя возможность для ДНК клетки, которая подошла к репликации, имея повреждения, не устраненные с помощью всех перечисленных выше механизмов репарации. В таком случае клетка может погибнуть, так как репликация на первом же неустраненном повреждении может «застопориться».

Вместе с тем, клетка имеет предназначенный для таких целей крайне рискованный механизм, получивший название SOS-репарации ДНК. Этот механизм был впервые обнаружен в 1953 г. Дж. Уэйглом и

в 1974 г. назван М. Радманом W-реактивацией (возможность для димеров тимина «дожить» до следующей репликации). В ходе механизма SOS-репарации индуцируется синтез белков, присоединяющихся к ДНК-полимеразному комплексу и «загрубляющих» его работу таким образом, что подпорченный комплекс становится способным строить дочернюю нить ДНК напротив дефектных звеньев матричной нити, и при этом на дочерней нити появляется много ошибок (мутаций). В результате клетка спасается от гибели на данном этапе и может обеспечить митоз, хотя будут ошибки и высокий риск гибели клетки.

Следует отметить, что перечисленные выше механизмы репарации молекулы ДНК относятся в основном к достижениям классической генетики. Вместе с тем, в последние десятилетия благодаря достижениям международной научной программы «Геном человека» (см. главу 1) общий список механизмов репарации ДНК был существенно дополнен другими ранее малоизвестными и новыми механизмами.

Восстановление молекулы ДНК с помощью механизмов, открытых в последние годы

Механизм репарации с участием фермента поли-АДФ-рибозаполимеразы

Белок-фермент поли-АДФ-рибоза-полимераза (ПАРП) относится к одному из ядерных факторов, первым распознающим повреждение ДНК. Этот фактор управляет запуском механизма репарации ДНК в живых клетках, начиная с места повреждения ДНК, и входит в мультипротеиновый комплекс (МР-комплекс), включающий еще фактор XRCC1, ДНК-лигазу III и бета-ДНК-полимеразу.

Присутствие ПАРП в этом комплексе обеспечивает направление всех участников репарации ДНК к сайтам повреждения ДНК in vivo, что облегчает восстановление молекулы ДНК.

Входящий в состав МР-комплекса фактор XRCC1 условно относится к «строительным лесам», индивидуально взаимодействующим с каждым компонентом комплекса в качестве опорной молекулярной структуры. С тех пор, как было обнаружено полиАДФ-рибозилирование этого фактора in vitro, было предположено, что ПАРП способен регулировать активность МР-комплекса путем модифицирования XRCO-белка in vivo, что нарушает его взаимодействие с другими компонентами комплекса. В пользу такого предположения свидетельствовали данные, что сверхэкспрессия фактора XRCC1 подавляет активность ПАРП in vivo.

В настоящее время эта гипотеза продолжает изучаться; ее подтверждают данные, что входящая в МП-комплекс ДНК-лигаза III ингибирует активность ПАРП in vitro, когда ее количество превышает количество ПАРП.

Модель репарации с антирекомбинационным эффектом фермента поли-АДФ-рибоза-полимеразы

В последние годы предложена модель репарации ДНК с антирекомбинационным эффектом ПАРП (Satoh and Lindahl, 1992). Согласно этой модели, ПАРП взаимодействует с разрывами ДНК и совместно с реакциями поли-АДФ-рибозилирования соседних белков специфически защищает концы ДНК от действия нуклеаз и/ или блокирует процесс рекомбинации. Это подтверждается на примере экспериментальных животных, дефицитных по гену ПАРП. Показано, что отсутствие ПАРП стимулирует процесс рекомбинации и ведет к увеличению у них частоты образования лимфом. Кроме того, ПАРП может «рекрутировать» факторы репарации ДНК путем модификации хроматиновых белков.

Репарация ДНК с участием метилтрансфераз

При помощи поддерживающих ферментов цитозин-ДНКметилтрансфераз (М-таз) можно проводить de novo метилирование остатков цитозина в ДНК с образованием 5-метилцитозина (5-mC), а также метилирование олигонуклеотидов, содержащих ошибочно спаренные основания.

Репарация ДНК с участием хеликаз

Среди ферментов, участвующих в репарации ДНК, большое внимание уделяется группе ДНК-хеликаз (хилаз). Это филогенетически устойчивые ферменты, способные разделять цепи молекулы ДНК, переводя ее из нативного состояния в одноцепочечное. Хеликазы участвуют во всех фундаментальных генетических процессах с разделением родительских цепей молекулы ДНК или основанных на таком разделении процессах: репликации, транскрипции, рекомбинации, репарации, сегрегации хромосом, процессинга и сплайсинга пре-мРНК, транспорта мРНК в цитоплазму и ее трансляции на рибосомах (см. главы 2 и 3). В ходе этих процессов хилазы обеспечивают доступ к открываемым ими одноцепочечным участкам молекулы ДНК для действия других ферментов. Хилазы отличаются друг от друга направлениями активности (3" - 5" и 5" - 3") цепи ДНК, предпочтительным сродством с 3"- и 5"-концами цепи ДНК, сродством с кофакторами - нуклеотидтрифосфатами. Эти энергозависимые фер-

менты расходуют энергию, образующуюся при гидролизе нуклеотид- 5"-трифосфатов (обычно это АТФ), и действуют в присутствии ионов Mg 2 +. При проведении какого-либо генетического процесса хилазы, как правило, объединяются в комплексы.

По сродству к субстрату хилазы делятся на группы: ДНК-хеликазы, РНК-хеликазы и хеликазы, работающие на гибридных молекулах РНК/РНК. Первые участвуют в инициации транскрипции, рекомбинации, репарации и сегрегации хромосом. Вторые участвуют в биогенезе рибосом, транскрипции мРНК, сплайсинге пре-мРНК, созревании и транспорте мРНК в цитоплазму и ее трансляции на рибосомах.

Хилазы классифицируются по активности (способности двигаться вдоль молекулы ДНК, разделяя ее на отдельные цепи), наличию 7 специфических мотивов последовательностей аминокислот, присущих всему семейству хилаз, но не обязательных для отдельных из них. Эти мотивы обозначаются цифрами: I, Ia, II, III, IV, V и VI (они обеспечивают связи хилаз с ДНК и координацию движения во время катализа). И хотя эти мотивы специфичны для хилаз, они также обнаруживаются у белков, использующих нуклеотидтрифосфаты в качестве кофактора (подобно хилазам). Мутации этих мотивов вызывают дефицит АТФ-зависимой активности хилаз. Наряду с хилазами выделены белки с мотивами, не обладающие хилазной активностью. Их также оказалось 7, и они получили название белков-претендентов в хилазы. Полагают, что такие белки должны также участвовать в регуляции внутриклеточных генетических процессов.

Кроме того, были выделены 2 механизма перемещения хилаз с разной скоростью по нуклеотидной цепи молекулы ДНК: активно катящаяся модель и постепенно скользящая модель.

Первый механизм осуществляется димером ДНК-хеликазы, который за один цикл (поворот молекулы) разъединяет определенное число н.п.

Второй механизм осуществляется мономером ДНК-хеликазы, движущимся с определенной скоростью.

Количество и свойства генов, кодирующих хеликазы в геноме человека, окончательно не определены, но некоторые гены хорошо изучены. Это гены хеликаз, входящие в семейства TFIIH и RecQ. Причем первое семейство является основным транскрипционным фактором, состоящим из девяти субъединиц, включающих две хилазы (XPB и XPD), 4 белка (p62, p52, p44 и p34), САК-комплекс, акти-

вирующий киназу (CDK-activating-kinase), и 2 циклина (Н и Cdk7).

TFIIH обладает АТФ-зависимой хеликазной и киназной активностью, за которую отвечают соответственно субъединицы XPB и XPD. Киназная активность обеспечивается еще и комплексом САК.

Показано также, что TFIIH участвует в репарации ДНК («узнает» участок ДНК длиной 20-30 н.п., содержащий повреждение, и вырезает его) и служит фактором транскрипции (взаимодействует с промоторной областью, раскручивая участок ДНК длиной 11-13 н.п. вокруг сайта инициации транскрипции).

Репарация нонсенс-транскриптов мРНК

Примерно одна треть наследственных болезней и многие формы рака обусловлены нонсенс-транскриптами или мутациями сдвига рамки считывания (см. главу 5). В результате этих мутаций возникают ПСК и появляются неполноценные белки.

Вместе с тем в клетках существуют системы, распознающие и разрушающие большинство нонсенс-транскриптов. Две такие (универсальные для эукариот) системы получили название: NMD и SMD (см. главу 7).

Завершая рассмотрение клеточных систем репарации ДНК, следует отметить, что восстановление дефектов, возникающих в молекуле ДНК в результате воздействия на нее мутагенных факторов, является важнейшим свойством всех живых организмов.

Среди увеличивающегося количества механизмов репарации ДНК есть механизмы простые, запускаемые сразу после повреждения молекулы ДНК, и сложные, растянутые во времени и требующие синтеза целого ряда ферментов. К последним относятся механизмы, связанные с разными этапами жизненного цикла клетки, а также спасением клетки в SOS-порядке или порядке введения новых мутаций в молекуле ДНК. Все восстановительные механизмы имеют общие патогенетические особенности и тесно переплетаются с процессами канцерогенеза, мутагенеза, тератогенеза и старения клетки и организма.

БОЛЕЗНИ ГЕНОМА

Болезни генома (генетической нестабильности) представлены во всех областях молекулярной медицины. Еще со времен классической генетики наиболее известными из них считаются болезни репарации

В России в 80-90-е годы XX в. болезни репарации ДНК изучались под названием болезней генетической (хромосомной) нестабильности, что соответствовало их ведущему признаку - повышенной ломкости хромосом.

В настоящее время спектр этих болезней значительно расширен. Наряду с классическими болезнями репарации ДНК, такими, как атаксия-телеангиэктазия (АТ), анемия Фанкони (АФ), пигментная ксеродерма (ПК), прогерия Хатчинсона-Гилфорда (ПРХГ), синдром Блума (СБ), к этому классу принадлежат следующие группы заболеваний:

Аутоиммунные заболевания: системная красная волчанка, склеродермия, ревматоидные артриты и др.;

Наследственные ферментопатии: Кнаппа-Комровера, Леша- Найана, Пендреда и др.;

Хромосомные синдромы: Дауна, Клайнфельтера, Патау, Шерешевского-Тернера и Эдвардса; ретинобластома, обусловленная делецией хромосомы 13 (13q14);

Моногенные болезни: атаксия Фридрейха, болезнь Дарье-Уайта, синдромы Гарднера, базально-клеточного невуса, Марфана, Ротмунда-Томсона, Корнелии де Ланге, тестикулярная феминизация, фотодерматоз и др.;

Полигенные болезни: псориаз, системный склероз и др. Генетическая нестабильность проявляется также у практически

здоровых носителей сбалансированных перестроек хромосом, например, при транслокации робертсоновского типа между хромосомами

Общими клиническими проявлениями болезней генома служат: выраженные неврологические проявления, снижение продолжительности жизни, симптомы преждевременного старения, повышенная частота развития злокачественных опухолей.

В первую очередь рассмотрим примеры классических болезней генома, или болезней репарации ДНК.

Моногенные болезни, связанные с повышенной фоточувствительностью и нарушением эксцизионной репарации ДНК

Наиболее известным заболеванием этого класса является ПК. Ее частота в популяции составляет 1:40-250 тыс. человек. ПК - это первая болезнь репарации ДНК, описанная у человека. Она гетерогенна: имеет 7 групп комплементации - А, В, С, D, E, F и G. В частности,

группа A широко распространена в Японии, где она составляет примерно 20% от всех больных ПК, и ее связывают с дефектом в системе пострепликативной репарации (ХР та1). Группы комплементации B и C распространены в странах Европы, а группы D, E, F и G - в других странах мира.

Ген ПК группы А локализован в локусе 9q34.1. Его продуктом служит ДНК-связывающий белок, имеющий два мотива типа «цинковые пальцы» (см. главу 8).

Ген ПК группы В картирован в локусе 2q21, его белковым продуктом служит геликаза, входящая в состав TFIIH-фактора транскрипции (см. выше).

Ген ПК группы С картирован на хромосоме 3, он кодирует белок р125. Функция этого белка окончательно не определена, хотя известно, что совместно с белком р58 он участвует в восстановлении репарационной активности.

Ген ПК группы D картирован в локусе 19q13.2-q13.3, его белковый продукт (подобно продукту гена ПК группы В) характеризуется геликазной активностью. Полагают, что оба генных продукта - это две субъединицы одного TFIIH-фактора.

Ген ПК группы F картирован в локусе 16р13.13, он продуцирует эндонуклеазу, надрезающую ДНК с 5"-стороны.

Ген ПК группы G картирован в локусе 13q33 и также продуцирует эндонуклеазу, но надрезающую ДНК уже с противоположной 3 "-стороны.

Основными симптомами этой болезни являются: высокая чувствительность к действию УФО, пигментация, сухость, изъязвление и рубцы кожи. У больных развивается рак кожи и слизистых оболочек (меланомы, карциномы).

В каждом втором-третьем случае выражена неврологическая симпоматика (связана с ранней апоптотической гибелью нейронов).

В последние годы установлено, что 3 из 7 групп комплементации ПК (группы В, D и G) могут проявляться как генокопии другой болезни репарации ДНК - синдрома Коккейна (СК), обусловленного дефектами эндонуклеаз системы эксцизионной репарации.

В подобных случаях у больных ПК можно выделить общие с СК клинические признаки, включая повышенную чувствительность к УФО. Поэтому и диагнозы у таких больных обозначаются как ПКВ/ СК, ПKD/СК, ПKG/СК.

Вместе с тем, СК - это второе заболевание (после ПК), описанное как болезнь эксцизионной репарации. Данный синдром проявляется карликовостью (при нормальном уровне гормона роста), кальцификацией костей черепа, атрофией зрительных нервов, глухотой и ускоренным старением. При этом синдроме выявлены две группы комплементации: А и В. Ген СК группы А локализован в локусе 5р12-р14, он кодирует белок, входящий в состав транскрипционного комплекса TFIIH (cм. выше). Ген СК группы В локализован в локусе 10q11.2, он кодирует белок, имеющий общие последовательности нуклеотидов с фактором, контролирующим транскрипцию и репарацию у E. coli, а у человека он, по-видимому, привлекает белки эксцизионной репарации в район остановившейся транскрипции.

Третья болезнь репарации ДНК - это трихотнодистрофия (ТХД). При этом заболевании гиперчувствительность к УФО проявляется примерно у половины больных.

Болезнь сопровождается повышенной ломкостью волос, что связано с уменьшением концентрации в них серосодержащих белков, имеющих дефицит цистеина.

К основному симптомокомплексу относятся: аномалии развития зубов и кожи, ихтиоз, задержка полового развития, физическая и умственная отсталость, предрасположенность к раку кожи.

В ряде случаев установлено соответствие дефекта репарации ДНК при ТХД дефектам репарации, отмеченным при всех группах комплементации ПК, кроме группы В.

Особенно часто такое соответствие характерно для гена ПК группы D. В связи этим было предположено, что ген ПК D полифункционален и его белковый продукт принимает участие в эксцизионной репарации и транскрипции, зависимой от РНК-полимеразы П. Кроме того, в клетках больных с ТХД производятся не две, а четыре субъединицы фактора транскрипции TFIIH.

Четвертое заболевание, связанное с повышенной фоточувствительностью и нарушенной репарацией ДНК, - это синдром Блума (СБ).

Ген СБ, или ген BLM (Bloom-мутация), картирован в локусе 15q26 рядом с протонкогеном fes. Предполагается, что этот ген имеет ДНК-зависимую АТРазную и ДНК-зависимую геликазную активность, причем с первой связано поддержание стабильности хромосом в соматических клетках, а вторая играет ключевую роль в репарации ДНК.

Симптоматика СБ: пропорциональная пре- и постнатальная задержка роста, гиперили гипопигментация кожи, краснота на

лице в виде «бабочки», предрасположенность к опухолям, высокий уровень спонтанных хромосомных аберраций и СХО.

Моногенные болезни, связанные с двухнитевыми разрывами ДНК при полном отсутствии эксцизионной репарации

Единственный пример заболевания, связанного с двухнитевыми разрывами ДНК при полном отсутствии механизмов эксцизионной репарации, - АТ, или синдром Луи-Бар. Болезнь встречается с частотой 1:40-100 тыс. человек, характеризуется мозжечковой атаксией, телеангиэктазиями, иммунодефицитом, высокой ломкостью хромосом и предрасположенностью к злокачественным опухолям (см. главу 5).

В последние три десятилетия был изучен ряд генетических особенностей этого заболевания. Оказалось, что хромосомы больных с АТ имеют укороченные почти в 3 раза теломеры, они (хромосомы) высоко чувствительны к действию ионизирующей радиации и химических радиомиметиков, что проявляется в увеличении выхода хромосомных нарушений (двухнитевых разрывов) и снижении выживаемости соматических клеток, для которых характерна радиорезистентность синтеза ДНК, что проявляется в отсутствии синтеза белка р53, в норме отвечающего за задержку (остановку) митотического цикла на стадиях G 1 -S и G 2 -M, необходимую для репарации повреждений ДНК. Иными словами, клетки больных с АТ «просто не имеют времени» для восстановления нормальной структуры ДНК с помощью механизмов эксцизионной репарации. Поэтому для ликвидации двухнитевых разрывов ДНК в таких клетках используются механизмы пострепликативной репарации.

Моногенные болезни с нарушением эксцизионной репарации вне связи с фоточувствительностью и двухнитевыми разрывами ДНК

К болезням с нарушением эксцизионной репарации вне связи с фоточувствительностью и двухнитевыми разрывами ДНК относятся: анемия Фанкони (АФ) и прогероидные синдромы Хатчинсона- Гилфорда и Вернера.

Анемия Фанкони

АФ - это семейная гипоили апластическая анемия с врожденной недостаточностью гемопоэтического ростка костного мозга, нарушениями пигментации кожи, телеангиэктазиями, БАР и МАР

(см. главу 23), предрасположенностью к миелоидной лейкемии и другой симптоматикой.

Постоянным признаком заболевания служит спонтанная хромосомная нестабильность, выявляемая в клетках костного мозга, кожи и лимфоцитов.

АФ - это гетерогенная болезнь, имеющая 8 групп комплементации (А, В, С, D, E, F , G и H), в том числе для групп А и С гены картированы в локусе 9q22.3, однако их белковые продукты недостаточно изучены. Следует отметить противоречивость данных, относящихся к отсутствию у больных с АФ повышенной фоточувствительности ДНК, хотя такие данные ранее были получены (Higurashi M., Cohen P.E., 1975).

Прогерия Хатчинсона-Гилфорда

ПРХГ - это редко встречающееся заболевание (частота 1:1 млн человек). Продолжительность жизни больных обычно не превышает 15 лет. Ген болезни не локализован.

Основная симптоматика: низкий рост, «птичий профиль» лица, преобладание мозговой части черепа над лицевой, венозная сеть на коже головы и лба, сухая источенная кожа, отсутствие бровей и ресниц, часто тотальная алопеция, дефекты количества и формы зубов, полное отсутствие подкожно-жировой клетчатки, задержка физического, психомоторного и умственного развития; в моче - высокое содержание гиалуроновой кислоты. Больные, как правило, бесплодны.

Причины ранней смерти: инфаркт миокарда с генерализованным атеросклерозом и фиброзом, жировое перерождение тканей мозга и паренхиматозных органов.

В клетках больных ПРХГ установлены дефекты репарации сшивок ДНК-белок, индуцированных химическими соединениями; резко сниженное число Хейфлика и его взаимосвязь с врожденным укорочением теломер.

По аналогии с СК (см. выше) для детской прогерии (ХГ) предполагается аутосомно-рецессивный тип наследования, хотя возможна вновь возникшая аутосомно-доминантная мутация, обусловливающая укорочение теломер.

Синдром Вернера

Синдром Вернера (СВ) или прогерия взрослых, характеризуется преждевременным старением, проявляющимся только после периода половой зрелости организма. Больные рано седеют и лысеют (до 20 лет).

Ген болезни (ген WRN) локализован в локусе 8р12-р21, продуцирует фермент геликазу, но не входит в состав основного транскрипционного комплекса TFIIN. Именно эта особенность отличает СВ от ПК групп В и D и СК группы B, при которых активность геликазы имеет прямое отношение к репарации, связанной с транскрипцией.

Основная симптоматика: «стареющая кожа» (гиперпигментация, гиперкератоз, морщинистость, сухость, телеангиэктазии), глухой голос, изменения внутренних органов, характерные для стареющего организма (атеросклероз сердца и сосудов, катаракта, остеопороз, сахарный диабет; доброкачественные или злокачественные опухоли), в моче - высокое содержание гиалуроновой кислоты. Число Хейфлика резко ограничено не только по количеству делений, но и по продолжительности клеточного цикла (в 3-5 раз ниже нормы). В отличие от ситуации при ПРХГ, при СВ хромосомы больных не имеют укороченных теломер.

Онкологические заболевания, связанные с нарушением репарации

После описания ретинобластомы, обусловленной делецией хромосомы 13 (13q14; см. главы 17 и 25), начались интенсивные исследования роли генных мутаций при наследственно обусловленных формах рака. Было показано, что при многих формах рака генные мутации ведут к нарушению репарации неправильно спаренных оснований, возникающих как ошибки репликации (вследствие небольших делеций или инсерций). Такие мутации аналогичны мутации в гене mutS у E. coli, приводящей к нарушениям репарации неправильно спаренных оснований.

У человека мутация в одной из копий гена MSN2 обусловливает (с высокой вероятностью) развитие семейного неполипозного рака толстого кишечника (HNPCC) и рака эндометрия. Установлено также, что при этих заболеваниях в опухолевых клетках отсутствует вторая копия гена и отмечается крайне высокая частота микросателлитных повторов (в 100 раз выше нормы). Кроме того, у человека выявлены формы рака грудной железы, связанные с генами BRC1 и BRC2, формы болезни Альцгеймера, связанные с четырьмя генами (PS1-PS4) и геном прионного белка, а также другие примеры генокопирования ряда моногенных и полигенных заболеваний, ассоциированных с опухолями (см. главы 17 и 25).

© Шарова Н.П., Абрамова Е.Б.

Повреждение и починка ДНК,
или
“На всякую прореху найдется заплата”

Н.П.Шарова, Е.Б.Абрамова

Наталья Петровна Шарова, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН.
Елена Борисовна Абрамова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник того же института.

Записанная в ДНК генетическая программа любого живого существа - от простейшего одноклеточного до высокоорганизованного многоклеточного - сохраняется в череде потомков благодаря точному воспроизведению нуклеотидной последовательности в каждом поколении. Но если в главной наследственной молекуле возникают повреждения, а это случается даже спонтанно, изменения в ее структуре могут привести не только к разным патологиям тканей или органов, но и к передаче мутации потомству. И, как это ни удивительно, ДНК - единственная клеточная макромолекула, способная исправлять повреждения в собственной структуре. В ней даже закодирована информация о механизмах тех процессов, которые занимаются таким ремонтом (в строго научной среде их называют репарационными). Именно “починка” ДНК обеспечивает запас прочности организма.

Восстановление структуры ДНК особенно важно при формировании репродуктивных (половых) клеток и в эмбриональном развитии: во время активного синтеза новых цепей риск появления и повторения ошибок многократно увеличивается. Наследственная молекула должна залечиваться очень быстро, и делящиеся эмбриональные клетки “знают”, как это осуществить. Устраняются разные повреждения ДНК и в течение всей жизни организма. Начнем рассказ с известных к настоящему времени типов повреждений, чтобы затем рассмотреть механизмы починки, потому что от характера неисправности зависит, каким способом она будет ликвидирована.

Что может испортиться в ДНК

Поломки возможны в любом из образующих ДНК компонентов - и в азотистых основаниях, и в сахарофосфатном остове, причем как при копировании (репликации), так и при считывании (транскрипции) информации для последующего синтеза клеточных белков.

Часто случаются апуринизация того или иного нуклеотида и дезаминирование оснований. В первом случае рвутся гликозидные связи между пурином (аденином или гуанином) и дезоксирибозой, в результате чего эти основания выщепляются из цепи ДНК (место, в котором произошло такое событие, называют АП-сайтом). Второй случай - дезаминирование - приводит к образованию несвойственных для структуры ДНК соединений: вместо цитозина, аденина или гуанина появляются урацил, гипоксантин или ксантин, соответственно. Оба процесса спонтанные. За сутки в клетке человека апуринизация повторяется 5-10 тыс. раз, а частота дезаминирования составляет примерно 100 событий на полный геном.

Действие ультрафиолетового облучения приводит к насыщению двойных связей пиримидиновых оснований и образованию димеров из двух соседних пиримидинов в одной цепи ДНК. Ионизирующая радиация может вызвать несколько повреждений: разрыв пуринового кольца, фрагментацию основания, окисление апуринового сайта, а также одно- и двухцепочечные разрывы (это фактически разлом хромосом - главная причина летального действия ионизирующей радиации). Некоторые химические агенты способны сшивать цепи ДНК. Активные формы кислорода (ОН·, О 2 ·– , Н 2 О 2 , перекиси липидов и др.), постоянно генерируемые в процессах метаболизма, повреждают и основания, и дезоксирибозу, что способствует образованию новых ковалентных связей. Особенно подвержены окислительному действию соседствующие гуанины (GG). Это буквально “горячие точки” такого процесса, а его конечный результат - модифицированное производное гуанозина. Сахарофосфатные связи разрушаются в тех случаях, когда обе нити ДНК лишились пуринов в противолежащих друг другу местах или вблизи произошла фрагментация дезоксирибозы. Тогда рвутся сразу обе цепи ДНК. Источником структурных дефектов может быть и естественный процесс - репликация, если в комплементарных цепях появляются неспаренные нуклеотиды.

Слева - Нормальная молекула ДНК (фрагмент) и схемы образования наиболее частых повреждений - дезаминирования, апуринизации и циклобутановых димеров. При дезаминировании цитозин превращается в урацил, а аденин - в гипоксантин. Если разрывается связь между остатком дезоксирибозы и пуриновым основанием (здесь аденин и гуанин), в этом месте остается только сахарофосфатный остов, т.е. возникает апуриновый сайт. Под действием ультрафиолета в ДНК может образоваться циклобутановый димер из двух соседних пиримидинов (тиминов), находящихся в одной цепи (вверху ). Внизу - Повреждения, которые могут возникать в ДНК спонтанно или под действием разных агентов.

Клетка способна устранить перечисленные повреждения, несмотря на их различия, и восстановить структуру ДНК. Вполне понятно, что для этого требуются специальные механизмы. И хотя в частностях они отличаются один от другого и бывают весьма сложными, все же подчиняются общим принципам. Сначала опознается вид возникшей неисправности. Этим занимаются один белок или несколько (тогда они объединяются в месте изъяна в комплекс). Затем поврежденный участок вырезается в ходе ферментативных реакций, после чего ДНК-полимераза синтезирует правильный кусок ДНК. Завершается репарация сшиванием отдельных фрагментов цепи ДНК-лигазой. Такова общая схема, но каждый тип ремонта осуществляют собственные белки и ферменты, определяющие его индивидуальность. Не правда ли, эта схема напоминает обычное латание дыр на одежде?

Молекулярные ножницы и заплатки

Большая часть структурных нарушений в ДНК устраняется вырезанием (этот тип репарации специалисты называют эксцизионной; по-англ. excision repair ), которое осуществляют ферменты нуклеазы. Бракованное основание удаляется в одиночку или вместе с окружением - участками цепи в 2-10 нуклеотидов. Так вырезаются модифицированные и поврежденные основания, апуриновые сайты и места с одноцепочечными разрывами. (Данная разновидность названа эксцизионной репарацией основания; base excision repair, BER.) В случае более крупных неисправностей - возникновения пиримидиновых димеров или других объемных образований в ДНК, нарушающих структуру спирали, - клеточные ножницы отстригают испорченную часть в составе куска длиной в 30 нуклеотидов. (Это уже эксцизионная репарация нуклеотида, nucleotide excision repair, NER.)

Каков будет размер вырезаемого куска, а значит, и заплаты, зависит от самого повреждения и соотношения имеющихся в клетке ДНК-полимераз. Эти ферменты застраивают бреши, образовавшиеся после вырезания аномального участка, используя в качестве матрицы фрагмент противоположной цепи ДНК. ДНК-полимеразы (у эукариот их известно более 15) различаются по ряду признаков, в том числе по количеству нуклеотидов, которые они успевают встроить в растущую цепь за один акт связывания с дуплексом ДНК. Полимеразы b и l присоединяют всего один нуклеотид, т.е. накладывают маленькую заплатку (short patch путь BER, как говорят специалисты). Две другие ДНК-полимеразы - d и e - способны создать большую вставку, но для этого им нужен специальный помощник - белок PCNA (proliferating cell nuclear antigen ). Особенно зависим от него первый фермент - без помощника он “отваливается” от ДНК, встроив лишь один нуклеотид, а если PCNA удерживает на ней полимеразу d , то синтез идет до тех пор, пока фрагмент не достигнет нужной длины. Если в клетке не хватает той или иной ДНК-полимеразы, репарация может переключиться с одного пути на другой, т.е. с малой заплаты на большую (long patch путь BER). Клеточные линии фибробластов мышиных эмбрионов восстанавливают нормальную структуру на месте апуринизации преимущественно посредством малой заплатки (в 80% событий), а если в клетках поврежден ген ДНК-полимеразы b , починка проходит исключительно наложением большой заплаты. Кстати, способ латания дыр клеткой зависит и от того, сколько в ней содержится белка PCNA.

Мелкие неполадки. Если в ДНК изменено одно основание, его распознают, а потом вырезают N-гликозилазы, и в результате в цепи остается дезоксирибозофосфат (как при апуринизации). Далее сахарофосфатный остов надрезается АП-эндонуклеазой (класса II) с 5ў -стороны от этого промежуточного продукта, похожего на АП-сайт. Совсем удалить его клетка может двумя способами (short patch или long patch BER): вырезав только сам остаток дезоксирибозофосфата или вместе с окружающими двумя-десятью нуклеотидами. По размеру образовавшейся дырки синтезируется и заплата. Брешь в один нуклеотид застраивается ДНК-полимеразой b . Иное дело, если появившийся в ДНК АП-сайт еще и подвергся окислению или восстановлению. Такую структурную аномалию вместе с окружающими нуклеотидами вырезает другой фермент - нуклеаза FEN1, - а образовавшуюся брешь застраивают ДНК-полимеразы d или e , которые работают только с помощником - белком PCNA. Иногда короткие пробелы (длиной до 5-6 нуклеотидов) заполняют ДНК-полимеразы b или l . Помощник им не нужен, так как они сами могут временно “заякориться” на свободном 5ў -конце цепи, прилежащем к бреши, и задержаться на какое-то время на ДНК, чтобы осуществить ресинтез вырезанного участка.

Мы несколько лет занимаемся исследованием репарации у костистых рыб в период их эмбрионального развития. В этот период онтогенеза активно синтезируются новые цепи ДНК, и потому риск появления и повторения ошибок многократно увеличивается. Чтобы не произошло подобного, наследственная молекула должна очень быстро залечиваться. Сначала мы предположили, что делящиеся эмбриональные клетки должны иметь несколько равноценных способов устранения одного и того же повреждения. Таким способом одновременно восстанавливалась бы структура ДНК на всех поврежденных участках, и процесс успешно завершался бы даже в том случае, если другие пути репарации подавлены по какой-либо причине. Но вместо того, чтобы экспериментально подтвердить свое предположение, мы обнаружили неизвестный ранее вид репарации ДНК. Работая с эмбрионами и яйцеклетками вьюна (костистой рыбы), мы неожиданно столкнулись с самостоятельной застройкой довольно крупных брешей (до 10-13 нуклеотидов) ДНК-полимеразой d - тем самым ферментом, который, как только что упоминалось, не может обходиться без помощника PCNA. Но в эмбриональном периоде вьюна полимераза d в помощнике не нуждалась. Оказалось, что этот фермент способен связываться одновременно с обоими концами разорванной ДНК и прочно удерживаться там, пока не “залатает дырку” полностью. Этот механизм репарации ДНК в эмбриональных активно делящихся клетках ранее не был известен. Между тем он очень важен, особенно если учесть, что большой заплатой устраняется основное число возникших в ДНК дефектов. Открытый нами способ репарации уникален тем, что действует в экстремальных условиях: совсем без белка-помощника или при его незначительном количестве, а также в том случае, когда в клетке не хватает других ДНК-полимераз, которые обходятся без PCNA.

Не дырка, а затяжка. Ультрафиолетовые лучи вызывают ковалентное сшивание соседних пиримидинов (например, тиминов) в молекуле ДНК. В распознавании и вырезании образовавшихся циклобутановых димеров участвуют семь белков - продуктов генов семейства ХР (XPA-XPG). У человека мутации хотя бы в одном из них могут привести к возникновению наследственного заболевания - пигментной ксеродермы (xeroderma pigmentosum, ХР), которая проявляется в первые годы жизни ребенка. На не защищенных от солнечных лучей участках кожи появляются пигментные пятна и в конце концов может развиться рак кожи.

Зачем нужно так много белков, и как они действуют? Каждый из них играет строго определенную роль. Белок ХРА узнает пиримидиновый димер в ДНК и связывается с другими членами семейства. ХРВ и XPD входят в состав сложного белкового комплекса - фактора транскрипции IIH (TFIIH), который расплетает ДНК в участке, подлежащем вырезанию. Еще один белок - ХРС - удерживает этот комплекс на поврежденном участке ДНК, а два последних (их называют нуклеазами вырезания) - XPF и XPG - работают как ножницы. Первая нуклеаза разрезает 24-ю фосфодиэфирную связь с 5ў -стороны от димера, а вторая - 5-ю связь с 3ў -стороны. В результате их совместного действия образуется разрыв длиной примерно в 30 нуклеотидов .

Заделывают такую большую брешь ДНК-полимеразы d или e , но им нужен помощник PCNA. Более того, для работы первого фермента необходим еще один белок - репликативный фактор С (RFC). В присутствии АТФ он связывается с концом цепи ДНК, который подходит к бреши с 5ў -стороны, затем присоединяется PCNA и образуется нестабильный тройной комплекс. После гидролиза АТФ конформация репликативного фактора меняется так, чтобы удерживать PCNA будто раскрытыми пальцами. Сам же этот помощник за счет временного размыкания своей кольцевой формы насаживается на дуплекс ДНК. К образовавшемуся стабильному комплексу присоединяется ДНК-полимераза d , которая и застраивает большую брешь. Сходным образом работает комплекс с участием ДНК-полимеразы e . Как видно, в устранении объемных повреждений участников много, да и сам процесс довольно сложен.

Если в клетках гены активно транскрибируются (т.е. синтезируется матричная РНК), восстановление по типу вырезания нуклеотида протекает намного быстрее благодаря включению в процесс еще двух белков - CSA и CSB. У человека мутации в генах этих белков вызывают наследственное заболевание - синдром Кокэйна (Cockayne’s syndrom, CS), при котором замедляется рост, повышается фоточувствительность, возникают катаракта, кариес зубов и дерматозы. Если во время транскрипции осуществляющая ее РНК-полимераза II наталкивается на повреждение в ДНК, то связывается с белками CSA и CSB. Тогда быстрая доставка ферментов репарации к месту поломки гарантирована, они залатают прореху, после чего транскрипция может завершиться.

Ткацкие ошибки. Ошибки репликации и рекомбинация (обмен участками) между аллелями могут привести к появлению неспаренных нуклеотидов в цепи ДНК. Для устранения таких неполадок существует особый тип репарации - исправление ошибок спаривания (mismatch repair, MMR). Самый простой путь их коррекции - немедленно удалить неправильно встроенный нуклеотид с помощью все тех же ДНК-полимераз d или e (правда, с дополнительной - экзонуклеазной - активностью). Более сложный вариант осуществляют, совместно действуя, ферменты, которые способны вырезать поврежденный участок (ферменты эксцизионной репарации), и группа дополнительных белков. Они узнают одиночный неспаренный нуклеотид или петли длиной до четырех нуклеотидов. (Мутации генов этих белков у человека вызывают предрасположенность к раковым заболеваниям.) Как только дефект обнаружен, нуклеазы удаляют его вместе с 50-500 нуклеотидами с каждой стороны . Огромную брешь застраивают те же полимеразы, зависимые от PCNA и потому способные синтезировать длинные фрагменты ДНК.

Регуляция. PCNA (о нем уже шла речь как о помощнике в репарации) и белок 53 (р53) - главные регуляторы в клетке, ответственные за ее судьбу. Первый белок, PCNA, участвует в репликации, второй - р53 - в транскрипции. А что делают эти белки, если во время копирования ДНК возникло повреждение, устранить которое должна ДНК-полимераза d ? Белок 53 стимулирует синтез белка 21, а тот тормозит копирование ДНК и прохождение клеточного цикла. За время остановки репликации клетка успевает избавиться от дефекта. Как такое может быть, ведь репликация и репарация - это всегда синтез ДНК, в котором задействован один и тот же белок PCNA? Репликация останавливается из-за того, что р21 связывается с PCNA, значит, на репарацию его не будет хватать. Но нет: в области повреждения создается избыток PCNA, и оно успешно ликвидируется.

Некоторые ученые полагают, что при повышенном содержании р21 ресинтез ведет не полимераза d , а полимераза b , которая не чувствительна к действию р21. Мы же, исходя из наших результатов, предполагаем, что смены ферментов не происходит, а просто ДНК-полимераза d переключается с зависимого от PCNA заполнения брешей на независимый от этого белка синтез ДНК .

Когда структура ДНК восстановлена, ряд белков-регуляторов и ферментов, участвовавших в репарации, подвергаются гидролизу, который осуществляет 26S протеасома . К таким белкам относится, например, белок XPC. Кроме того, сама протеасома или входящий в ее состав регуляторный комплекс 19S могут играть роль молекулярных шаперонов, способствуя приобретению репаративными белками нужной конформации. В этом случае протеасома стимулирует коррекцию ДНК.

Сквозные разрывы

Сквозные разрывы в молекуле ДНК - это результат ионизирующего облучения, окисления или механического повреждения. Такие же поломки возможны в тех случаях, когда во время репликации на пути ДНК-полимераз встречается разрыв в одной цепи. Но двухцепочечные разрывы могут быть и промежуточными продуктами нормальных биологических процессов (например, рекомбинации в развивающихся лимфоидных клетках). Если клетка не может заштопать сквозные разрывы, это приведет к дестабилизации генома, мутациям и возникновению раковых опухолей, а иногда к запуску апоптоза (запрограммированной гибели клетки). У эукариот существует два основных способа устранить двухцепочечные разрывы: гомологичная рекомбинация (рекомбинационная репарация) и соединение негомологичных концов.

Последовательность реконструкции ДНК, в которой разорваны обе цепи, способом гомологичной рекомбинации (слева ) и соединением негомологичных концов.
Первый способ восстановления ДНК характерен для дрожжей (Saccharomyces cerevisiae ), второй - для млекопитающих, в том числе для человека.
Объяснения в тексте.

Если имеется гомологичный дуплекс ДНК, последовательность которого комплементарна хотя бы одному разорванному концу, возможна рекомбинационная репарация. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae это основной вариант, и зависит он от белка RAD52, а в случае мутаций гена Rad52 соединяются негомологичные концы, т.е. включается второй вариант репарации. У млекопитающих, напротив, второй способ главным образом и работает, а у дрозофилы оба пути равнозначны . Независимо от варианта репарации фрагменты разной длины просто вырезаются, последующее их восстановление не предусмотрено. Естественно, при этом нарушается первичная структура ДНК и теряется закодированная в удаленных участках информация. Но поскольку двухцепочечные разрывы сравнительно редки, клетке, по всей видимости, выгоднее пойти на такие жертвы, чем оставить ДНК разорванной.

Гомологичный обмен. Белок RAD52, от которого зависит рекомбинационная репарация у дрожжей, связывается, как только что упоминалось, с выступающими концами разорванных цепей ДНК, чем защищает их от действия экзонуклеаз. Затем RAD52 стимулирует присоединение белка RAD51 к тем местам, где находился сам. После этого один конец или оба внедряются в гомологичный дуплекс ДНК и происходит рекомбинация. Выступавшие из “прорехи” части ДНК вырезаются, и образовавшаяся брешь застраивается сразу с противоположных сторон, т.е. синтез фрагментов идет навстречу друг другу. В клетках дрожжей S.cerevisiae его осуществляют полимеразы d и e , которые нуждаются в PCNA и репликативном факторе (RFC), чтобы удержаться на оборванном конце ДНК и вести синтез. Правда, в застраивании бреши участвует еще и ДНК-полимераза a , единственная из многочисленных полимераз, способная инициировать синтез ДНК в репликативной вилке - там, где начинают расплетаться нити. Учитывая участие этого фермента в репарации сквозных разрывов ДНК, А.Холмс и Дж.Хэйбер предложили модель, по которой внедрение одного из разорванных концов в гомологичный дуплекс ДНК создает необычную репликативную вилку, где и синтезируются цепи . Репликация завершается, когда второй конец достигает разрыва. Оказавшийся лишним “повисший” концевой участок второй цепи удаляется нуклеазой.

С гомологичной рекомбинацией связан еще один способ латания мест разлома. Разорванные концы ДНК по кусочку отрезаются специфической экзонуклеазой в обоих направлениях от разрыва до тех пор, пока не откроются комплементарные последовательности. Затем следует отжиг (спаривание) комплементарных участков и подрезание “висящих” негомологичных хвостов ДНК. Этот путь репарации также зависит от белка RAD52.

Соединение негомологичных концов. Починка этим способом ДНК, разорванной в обеих цепях, обеспечивается целым набором белков. Это белок Ku и комплекс, образованный ДНК-лигазой IV и продуктом гена XRCC4 . Все они консервативны у эукариот, включая дрожжи и млекопитающих. Несмотря на то, что в ходе репарации порванные концы соединяются напрямую, без использования матрицы для синтеза, процесс должен быть максимально аккуратным и точным. Для выполнения этого требования служит белок Ku, который представляет собой гетеродимер из субъединиц Ku70 и Ku80 (молекулярная масса 70 и 80 кДа соответственно). Недавно была исследована кристаллическая структура человеческого гетеродимера, а также структура его комплекса с фрагментом ДНК в 55 нуклеотидов. Оказалось, что гетеродимер Ku кольцом обвивается вокруг дуплекса ДНК, но при этом не контактирует с основаниями ДНК, а образует несколько связей с сахарофосфатным остовом и подгоняется пространственно к виткам спирали ДНК так, чтобы они расположились в кольце белка строго определенным образом. Такая конфигурация комплекса Ku и ДНК, очевидно, необходима для поддержания той структуры выступающих оборванных концов, которая пригодна для следующих этапов репарации.

А их несколько. Сначала на оборванные концы ДНК “надевается” по гетеродимеру, затем они связываются друг с другом, образуя мостик. Именно к нему присоединяются и выполняют свои функции остальные участники: ДНК-полимераза заполняет бреши, образовавшиеся в результате соединения негомологичных концов ДНК; нуклеаза подрезает выступающие концы, если они оказались излишне длинными; лигаза IV сшивает восстановленные фрагменты в единое целое. У некоторых эукариот обнаружена ДНК-полимераза m, которая, видимо, и заполняет бреши в ДНК.

Когда сшиты цепи

Некоторые химические агенты, например, лекарства против рака (цисплатин, митомицин, псорален), вызывают образование межцепочечных сшивок ДНК . Такие неполадки эукариоты способны устранять, но механизмы репарации недостаточно ясны. Известно, что у почкующихся дрожжей S.cerevisiae она зависит от ферментных систем, обеспечивающих, например, удаление тиминовых димеров (о чем уже было сказано), и от рекомбинации. Эта же ферментная система из семи белков (ХРА-XPG) работает, как мы уже отмечали, и при исправлении человеческой ДНК со сшитыми цепочками. Только происходит все еще сложнее. Вспомним: один из белков, XPF, разрезает цепь ДНК с 5ў -стороны от повреждения на расстоянии 20(±5) нуклеотидов, другой, XPG, - с 3ў -стороны через 6(±3) нуклеотидов от димера. Однако в ДНК человека эти эндонуклеазы вырезают 22-28 нуклеотидов в одной цепи ДНК и лишь с одной стороны от сшивки, не затрагивая сам дефект. Почему же человеческая нуклеаза не разрезает цепь обычным образом, с обеих сторон от повреждения? Потому, полагают исследователи, что перед разрезанием двойная спираль должна быть расплетена (для этого служит фермент геликаза). Но расплести дуплекс она может не по соседству со сшивкой, а на отдалении от нее - на расстоянии 20(±5) нуклеотидов с 5ў -стороны. Расплетенный участок приобретает вид пузыря. Тогда-то одна эндонуклеаза, XPG, рвет цепь на положенном ей месте (т.е. ближе к дефекту), а другая, XPF, - приблизительно 27-ю фосфодиэфирную связь с 5ў -стороны от сшивки . Но это всего лишь первый этап репарации ДНК с межцепочечными сшивками.

Что же дальше? По одной из разработанных гипотетических моделей, дальше следует рекомбинация гомологичного дуплекса ДНК. Именно большая брешь в 22-28 нуклеотидов инициирует этот процесс. Но на стадии переноса цепи он блокируется, после чего специфическая эндонуклеаза разрезает ту же нить с другой стороны сшивки. Вновь образовавшийся интермедиат узнают компоненты “молекулярных ножниц” (системы эксцизионной репарации), и осуществляется второй раунд разрезания, теперь уже двойного, во второй нити. В результате высвобождаются сшитые олигомеры, и рекомбинация завершается. Таким образом, одна цепь оказывается репарированной рекомбинацией. Брешь во второй цепи застраивается ДНК-полимеразой с использованием первой в качестве матрицы.

Интересно отметить, что недавно у высших эукариот обнаружен белок, содержащий домены геликазы и ДНК-полимеразы. Мутации его гена значительно повышают чувствительность организма к агентам, вызывающим сшивки между цепочками ДНК. А поскольку и геликазная, и полимеразная активности необходимы на определенных этапах восстановления сшитой ДНК за счет рекомбинации, был сделан вывод об участии этого белка в таком репарационном процессе. Впоследствии уникальный белок назвали ДНК-полимеразой q.

Гипотетическая схема устранения межцепочечных сшивок ДНК. Объяснения в тексте.

Если повреждение не удалено

Итак, повреждения ДНК у эукариот бывают разнообразными. И хотя существуют эффективные механизмы устранения таких дефектов, иногда клетка не способна удалить их все до единого по тем или иным причинам. В этом случае на поврежденных участках матрицы репликация ДНК останавливается. До недавнего времени было непонятно, каким же образом осуществляется копирование ДНК на поврежденных участках, не устраняемых известными способами. Это выяснилось совсем недавно.

В последние несколько лет открыта новая группа ДНК-полимераз - z, h, k, i, m, REV1, - которая как раз и предназначена для избавления от подобных повреждений . Полимеразы z, h и m осуществляют ресинтез ДНК, если в ней оказались неустраненными циклобутановые димеры между соседними тиминами; два последние фермента, а также полимеразы k и REV1 - при сохранении окисленного гуанина и апуриновых сайтов, а полимераза REV1 успешно застраивает еще и места с О(6)-метилгуанином. Интересно, что z -полимераза “работает в паре” с полимеразой h или REV1, продлевая на несколько нуклеотидов пройденный ими поврежденный участок ДНК.

Перечисленные полимеразы во время репликации ДНК иногда встраивают правильные нуклеотиды против поврежденных участков матрицы, при этом структура ДНК не нарушается. В некоторых же случаях включаются ошибочные нуклеотиды, и тогда возникают мутации. В настоящее время новой группе ДНК-полимераз уделяется особое внимание, так как клеткам необходим энзиматический аппарат, способный синтезировать ДНК в ситуациях, когда репарация вырезанием неэффективна или невозможна, а риск накопления мутаций оправдан.

* * * Первоначально механизм, предназначенный для устранения повреждений в ДНК, видимо, возник вместе с клеткой. По мере эволюции организмов он усложнялся, появлялись новые варианты. Насколько важен такой механизм, можно судить по тому, что в устранении поломок ДНК задействовано несколько десятков генов, и на производство ферментов репарации клетка тратит большую часть своих ресурсов. Надежность сохранения нуклеотидных последовательностей ДНК у высших эукариот очень велика: например, в геноме млекопитающего, насчитывающем около 3 млрд пар оснований, в клетках зародышевого пути за год подвергаются заменам лишь 10-20 оснований, а ведь повреждаются тысячи нуклеотидов. Особой надежности требует эмбриональный период: когда клетки активно делятся, необходимо как можно быстрее починить многочисленные поломки и сохранить генетическую информацию неповрежденной. Системы, благодаря которым восстанавливается природная структура ДНК, не только защищают геном от всевозможных повреждений, но и обслуживают генетические процессы в клетке. И если по какой-либо причине нарушен сам процесс репарации, это может обернуться серьезными неприятностями для клеток и всего организма. Так возникают повышенная предрасположенность к тем или иным заболеваниям, вплоть до онкологических, и тяжелые наследственные болезни. Знание механизмов, приводящих к различным заболеваниям, крайне необходимо практической медицине, чтобы облегчить поиск путей их лечения. И уж конечно, знание устраняет очередной пробел в постижении мира, будь он даже молекулярным.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований. Проекты 00-04-49183, 03-04-49127.

Литература

1. Sharova N.P., Abramova E.B., Dmitrieva S.B., et al. // FEBS Lett. 2000. V.486. P.14-18.

2. Sancar A. // Annu. Rev. Biochem. 1996. V.65. P.43-81.

3. Wood R.D., Shivji M.K.K. // Carcinogenesis. 1997. V.18. P.605-610.

4. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов В.Л. // Мол. биология. 2002. Т.36. С.761-776.

5. Sekelsky J.J., Burtis K.C., Hawley R.S. // Genetics. 1998. V.148. P.1587-1598.

6. Holmes A.M., and Haber J.E. // Cell. 1999. V.96. P.415-424.

7. Haber J.E. // Trends Genet. 2000. V.16. P.259-264.

8. Kohn K.W. // Cancer Res. 1996. V.56. P.5533-5546.

9. Besshno T., Mu D., and Sancar A. // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.6822-6830.

10. Burgers P.M.J., Koonin E.V., Bruford E., et al. // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.43487-43490.

Для поддержания главных характеристик клетки или организма на протяжении их жизни, а также в ряду поколений наследственный материал должен отличаться устойчивостью к внешним воздействиям или должны существовать механизмы коррекции возникающих в нем изменений. В живой природе используются оба фактора. Третьим фактором является точность копирования нуклеотидных последовательностей материнской ДНК в процессе ее репликации.

Рис. 3. 13. Белки, участвующие в процессе репликации ДНК

ДНК-геликаза расплетает двойную спираль ДНК, разделяя ее полинуклеотидные цепи; дестабилизирующие белки выпрямляют участок цепи ДНК; ДНК-топоизомераза разрывает фосфодиэфирную связь в одной из полинуглеотидных цепей ДНК, снимая напряжение, вызываемое расплетенисм спирали и расхождением цепей в репликационной вилке; РНК-праймаза синтезирует РНК-затравки для дочерней цепи и для каждого фрагмента Оказаки; ДНК-полимераза осуществляет непрерывный синтез лидирующей цепи и синтез фрагментов Оказаки отстающей цепи; ДНК-лигаза сшивает фрагменты Оказаки после удаления РНК-затравки

По реакционной способности молекулы ДНК относятся к категории химически инертных веществ. Известно, что роль вещества наследственности может выполнять не только ДНК, но и РНК (некоторые вирусы). Считают, что выбор в пользу ДНК обусловлен ее более низкой по сравнению с РНК реакционной способностью.

Рассмотренный выше механизм репликации отличается чрезвычайно высокой точностью воспроизведения структуры ДНК. При удвоении ДНК ошибки возникают в среднем с частотой 1·10 -6 комплементарных пар оснований.

В поддержании высокой точности репликации важная роль принадлежит прежде всего ферменту ДНК-полимеразе. Этот фермент осуществляет отбор необходимых нуклеотидов из числа имеющихся в ядерном соке нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), точное присоединение их к матричной цепи ДНК и включение в растущую дочернюю цепь (см. рис. 3.10). Частота включения неправильных нуклеотидов на этой стадии составляет 1·10 -5 пар оснований.

Такие ошибки в работе ДНК-полимеразы связаны с возникновением измененных форм азотистых оснований, которые образуют «незаконные» пары с основаниями материнской цепи. Например, измененная форма цитозина вместо гуанина связывается водородными связями с аденином. В результате в растущую цепь ДНК включается ошибочный нуклеотид. Быстрый переход измененной формы такого основания в обычную нарушает его связывание с матрицей, появляется неспаренный 3"-ОН-конец растущей цепи ДНК. В этой ситуации включается механизм самокоррекции , осуществляемый ДНК-полимеразой (или тесно связанным с ней ферментом - редактирующей эндонуклеазой). Самокоррекция заключается в отщеплении ошибочно включенного в цепь ДНК нуклеотида, не спаренного с матрицей (рис. 3.14). Следствием самокоррекции является снижение частоты ошибок в 10 раз (с 10 -5 до 10 -6).

Несмотря на эффективность самокоррекции, в ходе репликации после удвоения ДНК в ней обнаруживаются ошибки. Особенно часто это наблюдается при нарушении концентрации четырех нуклеозидтрифосфатов в окружающем субстрате. Значительная часть изменений возникает также в молекулах ДНК в результате спонтанно происходящих процессов, связанных с потерей пуриновых оснований - аденина и гуанина (апуринизацией) - или дезаминированием цитозина, который превращается в урацил. Частота последних изменений достигает 100 на 1 геном/сут.

Содержащиеся в ДНК основания могут изменяться под влиянием реакционноспособных соединений, нарушающих их нормальное спаривание, а также под действием ультрафиолетового излучения, которое может вызвать образование ковалентной связи между двумя соседними остатками тимина в ДНК (димеры тимина). Названные изменения в очередном цикле репликации должны привести либо к выпадению пар оснований в дочерней ДНК, либо к замене одних пар другими. Указанные изменения действительно сопровождают каждый цикл репликации ДНК, однако их частота значительно меньше, чем должна была бы быть. Это объясняется тем, что большинство изменений такого рода устраняется благодаря действию механизма репарации (молекулярного восстановления) исходной нуклеотидной последовательности ДНК.

Механизм репарации основан на наличии в молекуле ДНК двух комплементарных цепей. Искажение последовательности нуклеотидов в одной из них обнаруживается специфическими ферментами. Затем соответствующий участок удаляется и замещается новым, синтезированным на второй комплементарной цепи ДНК. Такую репарацию называют эксцизионной, т.е. с «вырезанием» (рис. 3.15). Она осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют также дорепликативной .

Рис. 3.14. Схема процесса коррекции при синтезе ДНК:

I -включение в цепь ДНК нуклеотида с измененной (таутомерной) формой цитоэина, который «незаконно» спаривается с аденином; II - быстрый переход цитозина в обычную форму нарушает его спаривание с аденином; неспаренный 3"-ОН-конец синтезируемой цепи препятствует дальнейшему ее удлинению под действием ДНК-полимеразы; III - ДНК-полимераза удаляет незаконный нуклеотид, в результате чего вновь появляется спаренный с матрицей 3 "- ОН-конец; IV - ДНК-полимераза продолжает наращивание цепи на 3"-ОН-конце

Восстановление исходной структуры ДНК требует участия ряда ферментов. Важным моментом в запуске механизма репарации является обнаружение ошибки в структуре ДНК. Нередко такие ошибки возникают во вновь синтезированной цепи в процессе репликации. Ферменты репарации должны обнаружить именно эту цепь. У многих видов живых организмов вновь синтезированная цепь ДНК отличается от материнской степенью метилирования ее азотистых оснований, которое отстает от синтеза. Репарации при этом подвергается неметилированная цепь. Объектом узнавания ферментами репарации могут также служить разрывы в цепи ДНК. У высших организмов, где синтез ДНК происходит не непрерывно, а отдельными репликонами, вновь синтезируемая цепь ДНК имеет разрывы, что делает возможным ее узнавание.

Восстановление структуры ДНК при утрате пуриновых оснований одной из ее цепей предполагает обнаружение дефекта с помощью фермента эндонуклеазы, которая разрывает фосфоэфирную связь в месте повреждения цепи. Затем измененный участок с несколькими примыкающими к нему нуклеотидами удаляется ферментом экзонуклеазой, а на его месте в соответствии с порядком оснований комплементарной цепи образуется правильная нуклеотидная последовательность (рис. 3.15).

Рис. 3.15. Схема эксцизионной, дорепликативной репарации ДНК

При изменении одного из оснований в цепи ДНК в восстановлении исходной структуры принимают участие ферменты ДНК-гликозилазы числом около 20. Они специфически узнают повреждения, обусловленные дезаминированием, алкилированием и другими структурными преобразованиями оснований. Такие модифицированные основания удаляются. Возникают участки, лишенные оснований, которые репарируются, как при утрате пуринов. Если восстановление нормальной структуры не осуществляется, например в случае дезаминирования азотистых оснований, происходит замена одних пар комплементарных оснований другими -пара Ц-Г может заменяться парой Т-А и т.п. (см. разд. 3.4.2.3).

Образование в полинуклеотидных цепях под действием УФ-лучей тиминовых димеров (Т-Т) требует участия ферментов, узнающих не отдельные измененные основания, а более протяженные повреждения структуры ДНК. Репаративный процесс в этом случае также связан с удалением участка, несущего димер, и восстановлением нормальной последовательности нуклеотидов путем синтеза на комплементарной цепи ДНК.

В том случае, когда система эксцизионной репарации не исправляет изменения, возникшего в одной цепи ДНК, в ходе репликации происходит фиксация этого изменения и оно становится достоянием обеих цепей ДНК. Это приводит к замене одной пары комплементарных нуклеотидов на другую либо к появлению разрывов (брешей) во вновь синтезированной цепи против измененных участков. Восстановление нормальной структуры ДНК при этом может произойти и после репликации.

Пострепликативная репарация осуществляется путем рекомбинации (обмена фрагментами) между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК. Примером такой пострепликативной репарации может служить восстановление нормальной структуры ДНК при возникновении тиминовых димеров (Т-Т), когда они не устраняются самопроизвольно под действием видимого света (световая репарация ) или в ходе дорепликативной эксцизионной репарации.

Ковалентные связи, возникающие между рядом стоящими остатками тимина, делают их не способными к связыванию с комплементарными нуклеотидами. В результате во вновь синтезируемой цепи ДНК появляются разрывы (бреши), узнаваемые ферментами репарации. Восстановление целостности новой полинуклеотидной цепи одной из дочерних ДНК осуществляется благодаря рекомбинации с соответствующей ей нормальной материнской цепью другой дочерней ДНК. Образовавшийся в материнской цепи пробел заполняется затем путем синтеза на комплементарной ей полинуклеотидной цепи (рис. 3.16). Проявлением такой пострепликативной репарации, осуществляемой путем рекомбинации между цепями двух дочерних молекул ДНК, можно считать нередко наблюдаемый обмен материалом между сестринскими хроматидами (рис. 3.17).

Рис. 3.16. Схема пострепликативной репарации ДНК:

I - возникновение тиминового димера в одной из цепей ДНК;

II - образование «бреши» во вновь синтезируемой це­пи против измененного участка материнской молекулы после репликации (стрелкой показано последующее заполнение «бреши» участком из соответствующей це­пи второй дочерней молекулы ДНК);

III - восстановление целостности дочерней цепи вер­хней молекулы за счет рекомбинации и в нижней молекуле за счет синтеза на комплементарной цепи

Рис. 3.17. Межхроматидные обмены (указаны стрелками)

В ходе дорепликативной и пострепликативной репарации восстанавливается большая часть повреждений структуры ДНК. Однако, если в наследственном материале клетки возникает слишком много повреждений и часть из них не ликвидируется, включается система индуцируемых (побуждаемых) ферментов репарации (SOS-система). Эти ферменты заполняют бреши, восстанавливая целостность синтезируемых полинуклеотидных цепей без точного соблюдения принципа комплементарности. Вот почему иногда сами процессы репарации могут служить источником стойких изменений в структуре ДНК (мутаций). Названная реакция также относится к SOS-системе.

Если в клетке, несмотря на осуществляемую репарацию, количество повреждений структуры ДНК остается высоким, в ней блокируются процессы репликации ДНК. Такая клетка не делится, а значит, не передает возникших изменений потомству.

Вызываемая повреждениями ДНК остановка клеточного цикла в сочетании с невозможностью молекулярной репарации измененного наследственного материала может с участием белка, синтез которого контролируется геном р53, приводить к активации процесса самоликвидации (апотпоз) дефектной клетки с целью устранения ее из организма.

Таким образом, обширный набор различных ферментов репарации осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК, удаляя из нее поврежденные участки и способствуя поддержанию стабильности наследственного материала. Совместное действие ферментов репликации (ДНК-полимераза и редактирующая эндонуклеаза) и ферментов репарации обеспечивает достаточно низкую частоту ошибок в молекулах ДНК, которая поддерживается на уровне 1 · 10 -9 пар измененных нуклеотидов на геном. При размере генома человека 3 · 10 9 нуклеотидных пар это означает появление около 3 ошибок на реплицирующийся геном. Вместе с тем даже этот уровень достаточен для образования за время существования жизни на Земле значительного генетического разнообразия в виде генных мутаций.

РЕПАРАЦИЯ ДНК

Системы репарации

2 Эксцизионная репарация. Примеры и виды

3 Репарация ошибок репликации ДНК

4 Рекомбинантная (пострепликативная) репарация у бактерий

5 SOS-репарация

Системы репарации ДНК достаточно консервативны в эволюции от бактерий до человека и наиболее изучены у Е. coli.

Известны два типа репарации: прямая и эксцизионная

Прямая репарация

Прямая репарация - наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов.

1. Так действует, например, О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза

(фермент – самоубийца), которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина

У Е. coli может в 1 мин синтезироваться до 100 молекул этого белка. Аналогичный по функциям белок высших эукариот, очевидно, играет важную роль в защите от рака, вызываемого внутренними и внешними алкилирующими факторами.

ДНК-инсертаза

2. ДНК-инсертазами

фотолиаза

3. Тиминовые димеры "расшиваются" путем прямой репарацци при участии фотолиаз , осуществляющих соответствующее фотохимическое превращение . ДНК-фотолиазы представляют собой группу ферментов, активируемых светом, с длиной волны 300 - 600 нм (видимая область), для чего в их структуре имеется особый светочувствительный центр.

Они широко распространены в природе и обнаружены у бактерий, дрожжей, насекомых, рептилий, земноводных и человека. Эти ферменты нуждаются в разнообразных кофакторах (FADH, тетрагидрофолиевая кислота и др.), участвующих в фотохимической активации фермента. Фотолиаза Е. coli представляет собой белок с молекулярной массой 35 кДа, прочно связанный с олигорибонуклеотидом длиной 10-15 нуклеотидов , необходимым для активности фермента.

Примеры прямой репарации

1. Метилированное основание O 6- mG диметилируется ферментом метилтрансфераза О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (фермент – самоубийца), которая переносит метильную группу на один из своих остатков

цистеина

2. АР-сайты могут репарироваться путем прямой вставки пуринов при участии ферментов, называемых ДНК-инсертазами (от англ. insert- вставлять).

СХЕМА ПРИМЕРА ПРЯМОЙ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ДНК – метилированное основание O 6- mG демитилируется ферментом метилтрансферазой, который переносит метильную группу на один из своих остатков аминокислоты цистеина.

3. Фотолиаза присоединяется к тиминовому димеру и после облучения этого комплекса видимым светом (300-600 нм) димер расшивается

СХЕМА ПРИМЕРА ПРЯМОЙ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ДНК – Фотолиаза

присоединяется к тиминовому димеру и после облучения видимым спектром света этот димер расшивается

Эксцизионная репарация

(от англ. excision - вырезание).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Эксцизионная репарация включает удаление поврежденных азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.

МЕХАНИЗМ

В эксцизионной репарации обычно принимают участие несколько ферментов, а сам процесс затрагивает

не только поврежденный ,

но и соседние с ним нуклеотиды .

УСЛОВИЯ

Для эксцизионной репарации необходима вторая (комплементарная) цепь ДНК. Общая упрощенная схема эксцизионной репарации представлена на рис. 171.

ЭТАПЫ

Первым этапом эксцизионной репарации является вырезание аномальных азотистых оснований. Его катализируют группа ДНК- N -гликозилаз - ферменты, расщепляющие гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием.

ВАЖНОЕ ЗАМЕЧАНИЕ:

У человека ДНК- N -гликозилазы обладают высокой субстратной специфичностью: разные ферменты этого семейства распознают и вырезают различные аномальные основания (8-оксогуанин, урацил, метилпурины и др.).

У бактерий ДНК- N -гликозилазы такой субстратной специфичностью не обладает

ОБЩИЕ ФЕРМЕНТЫ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ

НАЗВАНИЕ	ФУНКЦИЯ	МЕХАНИЗМ
ДНК- N -гликозилазы	вырезание аномальных азотистых оснований	расщепляет гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием
АР-эндонуклеаза	создает условия для работы следующего фермента - экзонуклеазы	разрывает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте
экзонуклеаза	выщепляет несколько нуклеотидов	последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК

КОНКРЕТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫЕ ШАГИ ЭТОГО МЕХАНИЗА:

В результате действия ДНК- N -гликозилаз образуется АР-сайт, который атакуется ферментом АР-эндонуклеазой . Она разрывает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте и тем самым создает условия для работы следующего фермента - экзонуклеазы , которая последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК.

В клетках бактерий освобожденное место заполняется соответствующими нуклеотидами при участии ДНК-полимеразы I , ориентирующейся на вторую (комплементарную) цепь ДНК.

Поскольку ДНК-полимераза I способна удлинять З"-конец одной из цепей в месте разрыва в двуцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5"-конца того же разрыва,

т.е. осуществлять “ник-трансляцию” , этот фермент играет ключевую роль в репарации ДНК. Окончательное сшивание репарированных участков осуществляет ДНК-лигаза .

В клетках эукариот (млекопитающих)

Эксцизионная репарация ДНК в клетках млекопитающих сопровождается резким всплеском активности еще одного фермента – поли А D Р-рибозо-полимеразы . При этом происходит ADP-рибозилирование белков хроматина (гистонов и негистоновых белков), что ведет к ослаблению их связи с ДНК и открывает доступ ферментам репарации.

Донором ADP-рибозы в этих реакциях выступает NAD+ , запасы которого сильно истощаются при эксцизионной репарации повреждений, вызываемых рентгеновским облучением:

Отрицательно заряженные остатки ADP-рибозы из внутреннего состава молекулы NAD+ присоединяются через радикал глутаминовой кислоты или фосфосерина к белкам хроматина, что ведет к нейтрализации положительных зарядов этих белков и ослаблению их контакта с ДНК.

ЧТО ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ ГРУППА ФЕРМЕНТОВ

ДНК – гликозилазы

расщепляет гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием

что приводит к вырезанию аномальных азотистых оснований

ДНК - гликозилазы , участвующие в устранении окислительных повреждений ДНК в клетках прокариот и эукариот , весьма разнообразны и отличаются по субстратной специфичности, пространственной структуре и способам взаимодействия с ДНК.

К наиболее изученным ДНК-гликозилазам относятся:

эндонуклеаза III (EndoIII),

форм амидо пиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg),

Mut T и

Mut Y кишечной палочки.

Эндонуклеаза III Е. coli "узнает" и специфически выщепляет из ДНК окисленные пиримидиновые основания.

Этот фермент представляет собой мономерный глобулярный белок, состоящий из 211 аминокислотных остатков (мол. масса 23,4 кДа). Ген, кодирующий Endo III, секвенирован, установлена его нуклеотидная последовательность. Endo III представляет собой железосерный белок [(4 Fe -4 S )2+-белок], обладающий элементом надвторичной структуры типа "греческий ключ" (спираль - шпилька - спираль), служащим для связывания с ДНК . Ферменты с аналогичной субстратной специфичностью и сходной аминокислотной последовательностью выделены также из клеток быка и человека .

Форм амидо пиридин-ДНК-гликозилаза Е. coli "узнает" и выщепляет из ДНК окисленные гетероциклические основания пуринового ряда .

СХЕМА ЭКЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ СТАДИЯ 1

ДНК N

СХЕМА ЭКЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ

1 ДНК N гликозидаза удаляет поврежденное основание

АР эндонуклеаза вносит разрыв в ДНК

2 Экзонуклеаза удаляет ряд нуклеотидов

3 ДНК полимераза заполняет освободившийся участок комплементарными

Мононуклеотидами

ДНК лигаза сшивает репарированную цепь ДНК

Mut T - небольшой белок с молекулярной массой 15 кДа, обладающий нуклеозидтрифосфатазной активностью, который преимущественно гидролизует dGTP до dGMP и пирофосфата.

Биологическая роль Mut T заключается в предотвращении образования во время репликации неканонических пар А:G и А: 8-oxo-G .

Такие пары могут появляться в том случае, когда окисленная форма

dGTP (8-oxo-dGTP) становится субстратом ДНК-полимеразы.

Mut T гидролизует 8-oxo-dGTP в 10 раз быстрее, чем dGTP.

Это делает 8-oxo-dGTP наиболее предпочтительным субстратом Mut T и объясняет его функциональную роль.

Mut Y представляет собой специфическую аденин-ДНК-гликозилазу, расщепляющую N-гликозидную связь между аденином и дезоксирибозой аденозина, образующего неканоническую пару с гуанином.

Функциональная роль этого фермента заключается в предотвращении мутации

T:A - G:A путем отщепления неповрежденного остатка аденина из пары оснований A: 8-oxo-G.

Нуклеотидная эксцизионная репарация

(АТФ-зависимый механизм удаления повреждений из ДНК)

В последнее время в эксцизионной репарации особое внимание уделяют АТР-зависимому механизму удаления повреждений из ДНК. Этот вид эксцизионной репарации получил название нуклеотидная эксцизионная репарация (nucleotide excision repair; NER).

Она включает в себя ДВА ЭТАПА :

1. удаление из ДНК олигонуклеотидных фрагментов , содержащих повреждение, и

Эксинуклеаза

2. последующую реконструкцию цепи ДНК с участием комплекса ферментов (нуклеаз, ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы и др.).

Удаление фрагмента ДНК происходит по обе стороны поврежденного нуклеотида. Длина удаляемых олигонуклеотидных фрагментов отличается у прокариот и эукариот.

Удаление фрагмента ДНК у прокариот

Так, у Е. coli, В. subtilus, Micrococcus luteus вырезается фрагмент длиной 12-13 нуклеотидов,

Удаление фрагмента ДНК у эукариот

а у дрожжей, земноводных и человека - фрагмент, состоящий из 24-32 нуклеотидов.

Эксинуклеаза – фермент, удаляющий фрагменты ДНК

Выщепление фрагмента ДНК осуществляется ферментом эксинуклеазой (excinuclease). У Е. coli этот фермент состоит из 3 различных протомеров –

uvrA

uvr В

uvr С

каждый из которых выполняет определенную функцию в ходе эксцизионного выщепления фрагмента ДНК. Название этих белков дано по первым буквам слов "ultra violet repair".

Протомер uvr А обладает АТРазной активностью, связывается с ДНК в виде димера, осуществляя

первичное распознавание повреждения и

связывание uvr В

Протомер uvr В обладает:

1 . Латентной АТР-азной и латентной хеликазной активностью, необходимой для изменения конформаций и расплетания двойной спирали ДНК;

2. Эндонуклеазной активностью, расщепляя межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь со стороны З"-конца выщепляемого фрагмента.

Протомер uvr С действует как эндонуклеаза , вносящая разрыв в репарируемую цепь ДНК с 5"-конца вырезаемого фрагмента.

Таким образом, протомеры uvr A, uvr В, uvr С взаимодействуют с ДНК в определенной последовательности, осуществляя АТР-зависимую реакцию выщепления олигонуклеотидного фрагмента из репарируемой цепи ДНК.

Образовавшаяся брешь в молекуле ДНК реставрируется при участии ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы. Модель эксцизионной репарации с участием вышеперечисленных ферментов представлена на рис. 172.

Эксцизионные репарации у человека

Эксцизионные репарации у человека также имеют АТФ - зависимый характер и включают три основных этапа :

узнавание повреждения,

двойное разрезание цепи ДНК,

восстановительный синтез и

лигирование репарируемой цепи.

Однако, в эксцизионной репарации ДНК человека принимают участие

25 различных полипептидов ,

16 из которых участвуют в выщеплении олигонуклеотидного фрагмента, являясь протомерами эксинуклеазы ,

а остальные 9 осуществляют синтез репарируемого участка молекулы.

В репарационной системе ДНК у человека весьма существенную роль выполняют белки транскрипции –

РНК-полимераза II и

TF ПН - один из шести основных факторов транскрипции эукариот .

Следует отметить, что эксцизионная репарация у прокариот, как и у эукариот, зависит от функционального состояния ДНК:

транскрибируемая ДНК репарируется быстрее,

чем транскрипционно неактивная.

Этот феномен объясняется следующими факторами:

структурой хроматина,

гомологией цепей транскрибируемых участков ДНК,

эффектом повреждения цепей и его влиянием на РНК-полимеразу.

ВАЖНОЕ ЗАМЕЧАНИЕ:

КОДИРУЮШАЯ ЦЕПЬ ДНК (цепь хранения информации)

МАТРИЧНАЯ ЦЕПЬ ДНК (с неё происходит списывание информации)

Известно, что такие крупные повреждения, как образование тиминовых димеров , блокируют транскрипцию как у бактерий, так и у человека, если они происходят на матричной цепи ДНК (повреждения на кодирующей цепи не влияют на транскрипционный комплекс). РНК-полимераза останавливается в месте повреждения ДНК и блокирует работу транскрипционного комплекса.

Транскрипционно-репарационный фактор сцепления (TRCF) .

У Е. coli усиление репарации при транскрипции опосредуется одним специальным белком - транскрипционно-репарационным фактором сцепления (TRCF) .

Этот белок способствует :

1. отсоединению РНК-полимеразы от ДНК

2. одновременно стимулирует образование комплекса белков,

Осуществляющих репарацию поврежденного участка.

По окончании репарации РНК-полимераза встает на место и транскрипция продолжается (см. рис.).

Итак общая схема эксцизионной репарации

1. ДНК- N -гликозилаза удаляет поврежденное основание

2. АР –эндонуклеаза вносит разрыв в цепь ДНК

3. Экзонуклеаза удаляет ряд нуклеотидов

4. ДНК-полимераза заполняет освободившийся участок

Комплементарными нуклеотидами

5. ДНК лигаза сшивает репарированную цепь ДНК

Репарация ошибок репликации ДНК

путем метилирования

Ошибки спаривания азотистых оснований во время репликации ДНК происходят достаточно часто (у бактерий один раз на 10 тыс. нуклеотидов), в результате которых в дочернюю цепь ДНК включаются некомплементарные нуклеотидам материнской цепи нуклеотиды - мисмэтчи (англ. mismatch н е соответствовать ).

Несмотря на то, что ДНК-полимераза I прокариот обладает способностью к самокоррекции, ее усилия по устранению ошибочно присоединенных нуклеотидов иногда оказываются недостаточны , и тогда в ДНК остаются некоторые неправильные (некомплементарные) пары.

В этом случае репарация происходит с использованием определенной системы, связанной с метилированием ДНК . Действие этой системы репарации основано на том, что после репликации через определенное время (несколько минут) ДНК подвергается метилированию.

У Е. coli метилируется в основном аденин с образованием

N6-мeтил-аденина (N6-mA).

До этого момента вновь синтезированная (дочерняя) цепь остается неметилированной.

Если в такой цепи есть неспаренные нуклеотиды, то она подвергается репарации: Таким образом метилирование метит ДНК и

включает систему исправления ошибок репликации.

В этой системе репарации узнаются особые структуры:

последовательность G-N6-mA-T-С и следующая за ней деформация

в двойной спирали в месте отсутствия комплементарности (рис. ниже).

В устранении неспаренных нуклеотидов в полуметилированной молекуле ДНК принимает участие достаточно сложный комплекс ферментов репарации, который сканирует поверхность молекулы ДНК, вырезает участок дочерней цепи , прибегающей к мисмэтчам , а затем создает условия для застраивания

его нужными (комплементарными) нуклеотидами.

Различные компоненты этого комплекса обладают разными активностями нуклеазной,

хеликазной,

АТРазной,

необходимыми для внесения разрывов в ДНК и выщепления нуклеотидов, расплетания двойной спирали ДНК и энергетического обеспечения движения комплекса вдоль репарируемой части молекулы.

Сходный по структуре и функциям комплекс ферментов репарации выявлен и у человека.

Рекомбинантная (пострепликативная) репарация

В тех случаях, когда по тем или иным причинам вышерассмотренные системы репарации оказываются нарушенными, в цепях ДНК могут образовываться бреши (недорепарированные участки), имеющие иногда весьма существенные размеры , что чревато нарушением системы репликации и может привести к гибели клеток.

В этом случае клетка в состоянии использовать для репарации одной молекулы ДНК другую полученную после репликации молекулу ДНК, т. е. привлечь для этой цели механизм рекомбинации .

У бактерий

У бактерий в рекомбинантной репарации принимает участие белок Rec А . Он связывается с одноцепочечным участком ДНК и вовлекает его в рекомбинацию с гомологичными участками неповрежденных цепей другой молекулы ДНК .

В результате и разорванная (содержащая бреши), и неповрежденная цепи репарируемой молекулы ДНК оказываются спаренными с неповрежденными комплементарными участками ДНК, что открывает возможность репарации путем вышеохарактеризованных систем.

При этом могут происходить вырезание определенного фрагмента и

заполнение с его помощью бреши в дефектной цепи.

Возникающие при этом пробелы и разрывы в цепях ДНК восполняются с участием ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы .

SOS-репарация

Существование этой системы впервые постулировал М. Радман в 1974 г. Он же дал название этому механизму, включив в него международный сигнал бедствия "SOS" (спасите наши души).

И действительно, эта система включается тогда, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что угрожает жизни клетки . В этом случае происходит индукция активности разнообразной группы генов, задействованных в различных клеточных процессах, сопряженных с репарацией ДНК.

Включение тех или иных генов, определяемых количеством повреждений в ДНК, приводит к разным по значимости клеточным ответам (начиная со стандартной репарации поврежденных нуклеотидов и кончая подавлением клеточного деления).

Наиболее изучена SOS-репарация у Е. coli, главными участниками которой являются белки, кодируемые генами Rec A и Lex А .

Первый из них представляет собой полифункциональный белок Rec A , участвующий

в рекомбинации ДНК , а также

в регуляции транскрипции генов фага лямбда , поражающего Е. coli,

а второй (белок Lex А) является репрессором транскрипции большой группы генов, предназначенных для репарации ДНК бактерий. При его ингибировании или разрешении репарация активируется.

Связывание Rec А с Lex А приводит к расщеплению последнего и соответственно к активации генов репарации .

В свою очередь, индукция SOS-системы бактерии служит для фага лямбда сигналом опасности и приводит к тому, что профаг переключается с пассивного на активный (литический) путь существования, вызывая тем самым гибель клетки-хозяина .

SOS-система репарации выявлена не только у бактерий, но и у животных, и человека.

Гены, задействованные в SOS-репарации повреждений ДНК

Гены	Последствия активации гена
uvr А, В, С, D	Репарация повреждений вторичной структуры ДНК
Rec А	Пострепликативная репарация, индукции SOS-системы
lex А	Выключение SOS-системы
rec N, ruv	Репарация двунитевых разрывов
	Обеспечение рекомбинационной репарации
umu С, D	Мутагенез, вызванный изменениями свойств ДНК-полимеразы
sul А	Подавление клеточного деления

Заключение

Исправление повреждений в ДНК тесным образом связано с другими фундаментальными молекулярно-генетическими процессами: репликацией, транскрипцией и рекомбинацией. Все эти процессы оказываются переплетенными в общую систему взаимодействий, обслуживаемую большим числом разнообразных белков, многие из которых являются полифункциональными молекулами, задействованными в контроле реализации генетической информации в клетках про- и эукариот. В то же время очевидно, что природа "не скупится" на элементах контроля, создавая сложнейшие системы коррекции тех повреждений в ДНК, которые несут опасность для организма и особенно для его потомства. С другой стороны, в тех случаях, когда репарационных возможностей недостаточно для сохранения генетического статуса организма, наступает необходимость в программируемой клеточной смерти – апоптозе. .

СХЕМА НУКЛЕОТИДНОЙ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ У E . COLI С УЧАСТИЕМ ЭКСИНУКЛЕАЗЫ

1. ТРАНСКРИПЦИОННО НЕЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ

2. ТРАНСКРИПЦИОННО ЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ

3. ОБЩИЙ ЭТАП РЕПАРАЦИИ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

А - белок uvr А

Б - белок uvr В

С - белок uvr С

маленький черный треугольник – знак указывает на место повреждений

СХЕМА РЕПАРАЦИИ, СВЯЗАННАЯ С МЕТИЛИРОВАНИЕМ ДНК